袁翰，梁金，鄭欣，郭向可，李東亞，邱旭升，陳一心*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210008;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，江蘇南京 210008;3.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 210093)

大段骨缺損常見于高能損傷導(dǎo)致的骨折、骨腫瘤的廣泛切除，骨髓炎的清創(chuàng)手術(shù)。隨著車禍的增加，大段骨缺損的修復(fù)在臨床上越來越常見，至今仍是一大難題。臨床上，對(duì)于大段骨缺損的治療，單純植骨往往不能解決問題，植入的骨組織常常被吸收，自體骨移植供骨量有限且存在取骨區(qū)感染風(fēng)險(xiǎn)，而同種異體骨移植存在傳染疾病的可能［1］，這些缺點(diǎn)使得骨移植的應(yīng)用受到限制。因此，研制新型的骨修復(fù)材料，通過引導(dǎo)骨組織再生來修復(fù)大段骨缺損是目前的研究熱點(diǎn)［2，3］。現(xiàn)階段，運(yùn)用于臨床的骨組織修復(fù)材料存在力學(xué)性能不佳、骨誘導(dǎo)能力不足、生物相容性差等諸多缺陷［4，5］。

取向納米纖維材料能夠誘導(dǎo)細(xì)胞呈取向排布，并且增加細(xì)胞在其表面遷移的速率，甚至誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化［6］。蠶絲蛋白生物相容性較好，可作為制備納米纖維的原料。本研究通過制備合適尺度的取向納米蠶絲纖維，研究其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMSCs)的排列、遷移、增殖及成骨分化的影響，為其將來作為大段骨缺損的修復(fù)材料應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 資料與方法

1.1 靜電紡絲法制備不同取向度蠶絲蛋白納米纖維支架以熱堿法脫去蠶絲絲膠，得到純蠶絲蛋白纖維。蠶絲蛋白纖維溶解于CaCl2/乙醇/H2O混合溶液(摩爾比1∶2∶8)，混合溶液透析后蒸發(fā)干燥以取得蠶絲蛋白?？瞻讓?duì)照組采用旋涂法施加蠶絲蛋白水溶液后常溫真空干燥。蠶絲蛋白取向納米纖維材料采用2 000 r/min轉(zhuǎn)速下的滾軸(直徑6 cm)接收裝置取得，無序納米纖維膜于500 r/min取得。將所得蠶絲蛋白納米纖維材料包覆于直徑14 mm的細(xì)胞爬片表面并以75%乙醇溶液處理。

1.2 取向蠶絲蛋白納米纖維對(duì)BMSCs增殖力的影響 人骨髓來自健康獻(xiàn)髓者，獻(xiàn)髓者事先已簽署知情同意書。將采集到的抗凝骨髓用密度梯度離心法分離骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞。運(yùn)用差速貼壁法純化細(xì)胞，4～5 d傳代一次。收集4～6代BMSCs調(diào)整濃度2×105/mL，分布接種于鋪有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料的24孔板中，每組復(fù)設(shè)4孔。分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 棄培養(yǎng)液，每孔加入噻唑藍(lán)(MTT)5 mg/mL，孵育4 d后棄上清加入二甲基亞砜200μL，振蕩溶解15 min，于酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的光密度值，并設(shè)參考波長650 nm。細(xì)胞數(shù)量以吸光度單位來表示。

1.3 復(fù)合培養(yǎng)材料的形態(tài)學(xué)觀察 三組細(xì)胞以2×105/mL接種后，分布接種于鋪有實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組材料的24孔板中，培養(yǎng)3 d后，將試樣切割為4 mm×4 mm后制樣，在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞在納米纖維支架材料上的生長密度和形態(tài)分布。另取三組細(xì)胞共培養(yǎng)后材料以4%多聚甲醛(pH 7.4)固定15 min。以Triton X-100通透5 min后。以1μg 4’，6-二脒基 -2- 苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、5 μg/mL 鬼筆環(huán)肽常溫染色，抗熒光淬滅封片液封固。各組試樣于熒光顯微鏡下以496 nm和380 nm熒光激發(fā)成像，并使用Axio Vision軟件對(duì)各通道數(shù)據(jù)疊加處理。

1.4 不同取向度納米纖維膜力學(xué)性能測(cè)定 首先游標(biāo)卡尺測(cè)量取向與非取向納米纖維膜的厚度，然后將其切成寬30 mm×長30 mm的試樣，在材料拉伸試驗(yàn)機(jī)上測(cè)定強(qiáng)力與伸長。其中取向納米纖維材料測(cè)量兩次，分別沿取向方向(Y軸)和垂直取向方向(Z軸);無序納米纖維材料以方向隨機(jī)且通過試樣中心的軸線測(cè)量。從而得到強(qiáng)力-伸長曲線及有關(guān)力學(xué)指標(biāo)，每種試樣測(cè)定5次，取其平均值。夾持部分的長度為5 mm每邊、拉伸速度5 mm/min，記錄被測(cè)支架斷裂前的受力動(dòng)態(tài)變化，參數(shù)主要包括最大力(N)、最大力點(diǎn)的位移(mm)、拉抻強(qiáng)度(MPa)、最大力伸長率(%)、斷裂伸長率(%)等，并通過軟件計(jì)算拉伸強(qiáng)度和楊氏模量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 圖形化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過NIH Image J軟件處理。實(shí)驗(yàn)中其他數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)量化圖由SPSS計(jì)算并繪制。計(jì)量資料以(s)表示，三組各項(xiàng)指標(biāo)的比較采用多組數(shù)據(jù)方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 取向納米蠶絲纖維的制備 制備提取得到純蠶絲蛋白溶液，使蠶絲蛋白紡絲液以約0.5 mL/h穩(wěn)定連續(xù)的流出。調(diào)節(jié)接收距離及工作電壓，紡絲時(shí)間180 min。得到半透明膜狀取向納米蠶絲蛋白膜，電鏡下觀察取向納米纖維取向度好，非取向蠶絲蛋白納米纖維支架則呈無序分布。

2.2 取向納米蠶絲蛋白膜力學(xué)性能測(cè)定 通過材料拉伸試驗(yàn)機(jī)測(cè)定取向、非取向納米蠶絲蛋白力學(xué)性能指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。取向蠶絲纖維軸向方向的最大力大于徑向方向，最大力伸長率小于徑向方向及非取向材料。楊氏模量大于徑向方向及非取向材料。

表1 納米蠶絲蛋白膜力學(xué)指標(biāo)

2.3 BMSCs的體外分離、擴(kuò)增 用比重1.073 g/mL的淋巴細(xì)胞分離液分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)1 d后，未見明顯梭形貼壁細(xì)胞，大部分細(xì)胞為圓形未貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)4 d后全量換液，除去未貼壁細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，能看到散在存在的梭形貼壁細(xì)胞。1周后，數(shù)量稍微增多。至培養(yǎng)2周，已經(jīng)能看到明顯聚集的梭形BMSCs。

2.4 取向納米蠶絲蛋白膜對(duì)BMSCs形態(tài)的影響 在取向納米蠶絲蛋白膜表面，細(xì)胞形態(tài)變長，呈梭形，細(xì)胞沿蠶絲方向有序排列，而亂序及平滑蠶絲蛋白膜材料表面，細(xì)胞在各個(gè)方向生長，隨機(jī)排列(見圖1)。掃描電鏡觀察，細(xì)胞黏附于納米蠶絲蛋白表面，沿蠶絲蛋白取向方向生長，其形態(tài)受到取向排列的蠶絲蛋白的影響，在2根蠶絲蛋白之間呈梭形。而在平滑蠶絲蛋白材料表面，細(xì)胞長軸在各個(gè)方向隨機(jī)排列。局部觀察到黏附于蠶絲表面的細(xì)胞偽足(見圖2)。FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白結(jié)合后，顯示在各組實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白均沿細(xì)胞長軸方向。在平滑蠶絲蛋白材料及亂序納米蠶絲蛋白材料表面生長的BMSCs細(xì)胞均表現(xiàn)為梭形或多角形，細(xì)胞縱軸在各個(gè)方向隨機(jī)排列，而在取向納米蠶絲蛋白表面生長的BMSCs形態(tài)表現(xiàn)為充分伸長的梭形。細(xì)胞內(nèi)部可見沿細(xì)胞長軸方向排列的肌動(dòng)蛋白(見圖3)。

2.5 取向納米蠶絲蛋白對(duì)BMSCs增殖力的影響 MTT法測(cè)量細(xì)胞的增殖速率的結(jié)果示在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，三組材料表面BMSCs細(xì)胞均快速增殖。在培養(yǎng)3 d后，取向及亂序納米蠶絲蛋白組細(xì)胞增殖力明顯高于普通蠶絲蛋白組(P＜0.05)。從第4天開始，取向納米蠶絲蛋白組細(xì)胞增殖力明顯高于亂序納米蠶絲蛋白組(P＜0.05，見表2)。

表2 MTT法測(cè)定BMSCs增殖力(吸光度OD)

3 討 論

3.1 取向納米蠶絲蛋白的制備 靜電紡絲技術(shù)是用于制備納米纖維的常用技術(shù)，通過改變合成條件，可以制造出不同直徑、密度以及排列的納米纖維。通過近十幾年的發(fā)展，眾多學(xué)者已將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到對(duì)人造血管、創(chuàng)面覆蓋及引導(dǎo)組織修復(fù)方面的研究［7］。本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)接收裝置滾輪轉(zhuǎn)速及電場(chǎng)強(qiáng)度，分別得到亂序及取向的蠶絲蛋白，直徑在500～1 000 nm之間。滾輪轉(zhuǎn)速為2 000 r/min時(shí)，電鏡顯示蠶絲蛋白取向度良好，隨著滾輪轉(zhuǎn)速的降低，蠶絲蛋白的取向度逐漸降低。當(dāng)滾輪轉(zhuǎn)速降低至500 r/min時(shí)，蠶絲蛋白呈無序排列。厚度適中的半透明膜用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)既有利于在光鏡及顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，又具備一定的表面納米結(jié)構(gòu)，適合用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究。通過控制紡絲時(shí)間，可以控制蠶絲蛋白的厚度，我們選取180 min的工作周期，最終得到厚度為50～100μm半透明的蠶絲蛋白膜。體外細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，此種厚度的蠶絲蛋白納米纖維膜具有理想的實(shí)驗(yàn)效果。

3.2 取向納米蠶絲蛋白的力學(xué)分析 用于骨科的植入材料需要具有一定的剛性及韌性。蠶絲蛋白雖然具有生物相容性好、體內(nèi)可降解、易塑形等優(yōu)點(diǎn)，但是其剛性及韌性較差，不能滿足骨科植入材料的需要［8］。有研究通過加入聚乳酸等制備成為復(fù)合材料，能夠增加其韌性，用于神經(jīng)、血管等組織的修復(fù)［9，10］。但是加入的復(fù)合材料往往具有一定的生物毒性作用，體內(nèi)不能降解，有的需要二次手術(shù)取出，增加了醫(yī)療費(fèi)用的開支。本實(shí)驗(yàn)通過增加蠶絲蛋白的取向度，并且控制其直徑為納米級(jí)別(500～1 000 nm)，在不添加其余復(fù)合原料的情況下增加了蠶絲蛋白的軸向韌性，擴(kuò)寬了蠶絲蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，使將來取向納米蠶絲的臨床應(yīng)用成為可能。對(duì)于骨科領(lǐng)域，可增加取向納米蠶絲蛋白膜的厚度及密度，利于骨折斷端的輔助固定。

3.3 取向納米蠶絲蛋白對(duì)BMSCs形態(tài)的影響 人體骨骼組織中的膠原蛋白呈高度取向的束狀分布，是成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等生長所必需的細(xì)胞外基質(zhì)。我們所制備的取向納米蠶絲纖維材料具有高度取向性，并且具有適當(dāng)?shù)睦w維間隙，能夠提供細(xì)胞生長所需要的空間。它是一種模仿骨骼組織中細(xì)胞外基質(zhì)成分的良好結(jié)構(gòu)。電鏡及細(xì)胞骨架蛋白染色顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞良好地附著于蠶絲蛋白表面，并且在取向蠶絲的誘導(dǎo)下變?yōu)樗笮?，長軸增加，向著蠶絲取向方向更好地遷移排列。肌動(dòng)蛋白熒光染色更好地顯示了細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞有序排列，并且可以觀察到細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白呈相同方向束狀分布，這也初步解釋了細(xì)胞變長的可能機(jī)制。大量研究表明［6，11-19］，生長于取向納米纖維材料表面的細(xì)胞不僅表現(xiàn)為黏著蛋白、張力蛋白、肌動(dòng)蛋白等數(shù)量的變化，還檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)通路甚至基因表達(dá)的改變。

Lu等［16］在高取向度的納米纖維表面，觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞可有序排列，并存在67個(gè)基因的表達(dá)差異，大部分與過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)信號(hào)通路有關(guān)。因此我們推測(cè)，間充質(zhì)干細(xì)胞通過整合素家族信號(hào)通路將細(xì)胞外的物理刺激轉(zhuǎn)變?yōu)槟鼙患?xì)胞識(shí)別的生物信號(hào)并進(jìn)一步影響細(xì)胞命運(yùn)。我們從電鏡下觀察到BMSCs沿蠶絲取向方向伸出偽足黏附于蠶絲蛋白表面，這些現(xiàn)象都是細(xì)胞膜表面黏附蛋白與蠶絲蛋白相互作用的結(jié)果，與之前研究一致［6］。本實(shí)驗(yàn)中肌動(dòng)蛋白熒光染色后可以看到呈束狀排列并且有密度更高的肌動(dòng)蛋白，顯示了細(xì)胞骨架的改變。

3.4 取向納米蠶絲蛋白促進(jìn)BMSCs的增殖 目前對(duì)于成骨誘導(dǎo)材料的研究主要集中于兩方面，材料對(duì)成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，以及材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的促進(jìn)作用。隨著對(duì)材料表面物理形貌結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞影響研究的深入，越來越多的學(xué)者開始研制具備一定納米形態(tài)的材料，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖或者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。取向納米纖維材料是其中的一種，以往研究表明具備一定取向結(jié)構(gòu)的納米纖維能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化［6，12，14，15］。我們首次選用生物相容性較好的蠶絲蛋白，通過靜電紡絲的方法制備取向納米蠶絲蛋白，研究其對(duì)BMSCs的影響，結(jié)果示具備一定取向的納米蠶絲蛋白能夠促進(jìn)BMSCs的增殖活性，有利于骨折的愈合。

綜上所述，通過靜電紡絲法制備的蠶絲蛋白納米纖維支架可促進(jìn)BMSC在其表面的增殖。提高納米纖維的取向程度后，還可進(jìn)一步介導(dǎo)細(xì)胞的取向分布和成骨分化。材料具有獨(dú)特的力學(xué)特性，是一種極具潛力的骨修復(fù)生物材料。然而，取向納米纖維形貌如何影響B(tài)MSC的分化方向，以及取向蠶絲蛋白納米纖維支架于體內(nèi)應(yīng)用的效果，還需進(jìn)一步研究。

(本文圖1～3見后插頁)

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