王 瑛，周春霞，洪鵬志，劉慧清

（廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江，524088）

我國是羅非魚的養(yǎng)殖大國，也羅非魚的消費大國和貿(mào)易大國。2008年我國羅非魚出口量為22.4萬t，占我國水產(chǎn)品貿(mào)易的第二位，2011年羅非魚的出口量高達33萬[1]。由于其水分含量高，肌肉細嫩，死后很容易在微生物和酶的作用下發(fā)生變質(zhì)，且魚的收獲期相對集中，鮮活銷售量有限，捕獲后的產(chǎn)品如不采取適當(dāng)?shù)馁A藏措施會嚴重影響其市場流通和銷售。目前，水產(chǎn)品的保鮮方式主要有冷藏保鮮、冷海水保鮮、冰溫保鮮、微凍保鮮、冷凍保鮮和超冷快速保鮮。但是冷海水保鮮將魚體在冷海水中浸泡，魚體會因滲鹽吸水而膨脹，且魚肉略帶咸味，表面變色，魚肉蛋白容易損失，在以后的流通過程中容易提早腐爛；冰溫保鮮能利用的溫度區(qū)間很小，要求嚴格；微凍保鮮要求的溫度處于最大冰晶生成帶內(nèi)，容易引起蛋白質(zhì)變性；冷凍保鮮和超冷快速保鮮適用于羅非魚的長期貯藏。冰藏保鮮是以冰為介質(zhì)，將魚體的溫度降低至接近冰的融點。由于冰容易得到，冷卻能力大，與魚體接觸無害，價格便宜，便于攜帶，因此長期以來被用于水產(chǎn)品的保鮮[2]。但是雖然低溫能抑制酶的活性、微生物的生長，但在保鮮過程中依然伴隨著糖原分解、脂肪氧化、蛋白質(zhì)變性等現(xiàn)象的發(fā)生[3]。分析現(xiàn)有水產(chǎn)加工品的構(gòu)成，冷凍和冷藏加工品仍是最重要的組成部分，占了一半以上，但是關(guān)于冰藏期間羅非魚肉肌原纖維蛋白理化特性的變化的研究很少。本文主要探討了碎冰冷藏法對羅非魚肉肌原纖維蛋白理化特性的影響，進一步提高魚類貯藏的技術(shù)，以期望為羅非魚的貯藏、運輸和銷售提供理論參考，同時為構(gòu)建羅非魚品質(zhì)評價體系提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚 購于湛江市湖光市場；ANS Sigma公司，色譜純；5’-ATPNa2上海源葉生物科技有限公司，分析純；乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、二硫代二硝基苯甲酸、米吐爾等 廣州化學(xué)試劑廠，分析純。

RF-5301P型熒光分光光度計、UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津公司；CR22GⅡ型高速速凍離心機 日本日立有限公司；FJ-200型高速分散均質(zhì)機 上海標本模型廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 鮮活羅非魚每尾重約1kg，1h內(nèi)用冰保鮮運回廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)品重點加工實驗室后，除去內(nèi)臟和魚腮，清洗干凈后置于封口袋中，每3尾為一組，于封閉泡沫箱中加碎冰保存，下層冰厚約10cm，上層厚約5cm，每24h換冰一次，分別于冰藏第0、1、2、3、4、6、8、10、12、15d取樣測定。

1.2.2 pH的測定 按照GB/T 9695.5-2008肉與肉制品pH測定的方法進行。取10g羅非魚肉置于100mL 0.1mol/L的 KCl溶液中，勻漿20s后，直接用pH計進行測定，待讀數(shù)穩(wěn)定后讀取數(shù)值。

1.2.3 肌原纖維蛋白溶液的制備 肌原纖維蛋白溶液的提取參考萬建榮[4]的方法，并稍作修改：取200g碎魚肉樣品，添加4倍量的冰水，充分勻漿，然后在8000r/min下低溫（4℃）離心20min，重復(fù)3～5次后在沉淀中加入4倍量的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（0.6mol/L KCl，pH7.0），勻漿，于0～4℃的環(huán)境中提取18h，在4℃，8000r/min下離心20min，收集上清液，用雙縮脲法測定蛋白含量。

1.2.4 活性巰基的測定方法 活性巰基含量的測定參考Ellman[5]法，采用DTNB法測定。

1.2.5 Ca2+-ATPase活性的測定 Ca2+-ATPase活性的測定參考Benjakul的方法[6]。

1.2.6 表面疏水性的測定 采取的ANS熒光探針法[7]，檢測的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為380nm和480nm，狹縫寬為5nm。以相對熒光強度與蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始斜率即為蛋白質(zhì)的相對表面疏水性（ANS-S0）。

1.2.7 乳化性的測定 采用濁度法[8]測定肌原纖維蛋白的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。

1.2.8 感官評定 將冰藏后的羅非魚感官評價人員即時進行評測[9]，評定人員由10位經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員組成，分別對魚片的色澤、氣味、組織形態(tài)和肌肉彈性進行評定。魚體的綜合分值在15～20分為一級鮮度，9～15分為二級鮮度，8分以下為不新鮮。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 每個實驗樣品測定重復(fù)3～5次，用Origin 7.5進行數(shù)據(jù)處理，其值表示為：平均值±標準差。

2 結(jié)果與討論

2.1 碎冰冷藏對羅非魚肉pH的影響

圖1 冰藏對羅非魚肉pH的影響Fig.1 Effect of iced storage on the pH value of Tilapia muscle

在碎冰冷藏期間，羅非魚肌肉pH的變化如圖1所示。由圖1可知，在實驗范圍內(nèi)，隨著冰藏時間的延長，其pH呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，于冰藏的第2d達到最低點（pH6.67），很可能與魚體糖酵解過程有關(guān)。魚體停止呼吸后，組織呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧的糖酵解途徑，糖原分解產(chǎn)生乳酸，所以pH下降，但是隨著貯藏時間的延長，羅非魚體內(nèi)肌原纖維蛋白不斷降解，分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使得pH又升高[10]。

2.2 碎冰冷藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白含量的影響

碎冰冷藏期間羅非魚肌原纖維蛋白含量的變化如圖2所示。冰藏期間，肌原纖維蛋白含量隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。由圖2可知，新鮮羅非魚的肌原纖維蛋白的提取量并不是最高的，冰藏1d后提取量最大，高達135.73mg/g。這是由于羅非魚剛死后，其肌肉內(nèi)ATP的作用，使得肌球蛋白分子與肌動蛋白分子呈不可逆的強固結(jié)合，相互聚合形成了分子量較大的分子，在離心時沉降至沉淀部分[11]。冰藏第1～10d一直呈現(xiàn)迅速下降的趨勢，貯藏末期趨于平緩。肌原纖維蛋白含量逐漸降低主要是由于冰藏過程中蛋白質(zhì)變性發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，巰基氧化形成的二硫鍵會導(dǎo)致肌球蛋白重鏈發(fā)生聚合[12]。

表1 羅非魚肉的感官評價標準Table 1 Criteria of sensory evaluation of Tilapia muscle

圖2 冰藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白含量的影響Fig.2 Effect of iced storage on content of myofibrillar protein from Tilapia muscle

2.3 碎冰冷藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

圖3 冰藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的影響Fig.3 Effect of iced storage on the activity of Ca2+-ATPase of myofibrillar protein from Tilapia muscle

Ca2+-ATPase活性被廣泛用于表示肌球蛋白完整性的指標。在碎冰冷藏期間，羅非魚肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的變化如圖3所示。由圖3可知，冰藏期間，羅非魚肉肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢，其中前6d下降較為迅速，從開始的0.42μmolPi/mg·min迅速降至0.18μmol Pi/mg·min，之后變化趨于平緩。引起Ca2+-ATPase活性下降的原因主要為pH下降以及巰基氧化形成二硫鍵導(dǎo)致的分子聚合；可能是由于肌漿球蛋白的球狀頭部構(gòu)象的變化以及這部分蛋白的聚集或者相互作用發(fā)生重排導(dǎo)致的[13]。

2.4 碎冰冷藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響

在碎冰冷藏期間，羅非魚肉肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化如圖4所示。由圖4可知，冰藏期間，羅非魚肌肉中肌原纖維蛋白活性巰基的含量隨著貯藏時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢。其中前6d活性巰基含量下降較快，從開始的9.34×10-5mol/g迅速下降至3.34×10-5mol/g，之后變化趨于平緩。巰基含量的變化主要是肌球蛋白降解，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使埋藏在分子內(nèi)部的巰基暴露出來被氧化，導(dǎo)致其含量減少[6]。

圖4 冰藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白活性巰基的影響Fig.4 Effect of iced storage on the activity of sulfhydryl of myofibrillar protein from Tlapia muscle

2.5 碎冰冷藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

圖5 冰藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.5 Effect of iced storage on the surface hydrophobicity of myofibrillar protein from Tilapia muscle

ANS是所用疏水探針中應(yīng)用最廣泛的探針，它通過非共價的形式結(jié)合到蛋白質(zhì)分子的非極性區(qū)域，增強了熒光強度。在一定范圍內(nèi)，熒光強度與蛋白質(zhì)的濃度具有較好的線性關(guān)系[7]，這表征了蛋白質(zhì)疏水性基團的暴露情況。

在碎冰冷藏期間，羅非魚肉肌原纖維蛋白表面疏水性的變化如圖5所示。由圖5可知，冰藏期間，肌原纖維蛋白的表面疏水性呈上升趨勢，但是前4d上升較緩慢，第6～8d迅速上升，第8d后趨于平緩。冰藏期間，疏水性發(fā)生變化是由于不同氨基酸間的疏水作用及巰基的氧化影響了蛋白質(zhì)的疏水性；且由于蛋白質(zhì)的降解和變性作用，會使埋藏在內(nèi)部的分子暴露出來，導(dǎo)致疏水性增加[13]。

2.6 碎冰冷藏對羅非魚肌原纖維蛋白乳化性的影響

圖6 冰藏對羅非魚肉肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of iced storage on the emulsifying activity and emulsifying stability of myofibrillar protein from Tilapia muscle

在碎冰冷藏期間，羅非魚肉肌原纖維蛋白乳化性的變化如圖6所示。由圖6可知，冰藏期間肌原纖維蛋白的EAI和ESI均呈下降趨勢，其中前6d下降較緩慢，后期則迅速下降，貯藏時間在0～16d分別從41.24m2/g和44.78min下降至10.48m2/g和16.39min。蛋白質(zhì)的乳化特性是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與脂肪交聯(lián)能力的表征，乳化性受蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、聚集程度、pH、離子強度、粘度等一系列因素的影響，其中蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象及其聚集程度影響最大[14]。而且有關(guān)研究也表明，蛋白質(zhì)的乳化能力與溶解度呈正相關(guān)，即蛋白質(zhì)的含量越高，其乳化能力越好[15]。在冰藏過程中，羅非魚體內(nèi)肌原纖維蛋白不斷發(fā)生變性降解，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象發(fā)生變化，且蛋白質(zhì)含量逐漸降低，因而乳化性和乳化穩(wěn)定性逐漸降低。

2.7 碎冰冷藏對羅非魚肌肉感官的影響

圖7 冰藏對羅非魚肌肉感官分值的影響Fig.7 Effect of iced storage on the sensory evaluation value of Tilapia muscle

在碎冰冷藏期間，羅非魚肉肌原纖維蛋白感官的變化如圖7所示。綜合感官評分在冰藏期間隨著冰藏時間的延長而越來越低。在冰藏的前6d，魚肉一直保持著一級鮮度的狀態(tài)；冰藏的前10d內(nèi)，其品質(zhì)也一直保持新鮮的狀態(tài)，仍然可以食用；但是在冰藏后期其肌肉呈現(xiàn)腐敗的跡象，主要表現(xiàn)為顏色變暗，肉質(zhì)松散，并且有不良氣味的生成，不宜食用。因此碎冰冷藏對于羅非魚的短期貯藏效果很好，為羅非魚的貯藏、運輸和銷售提供了理論依據(jù)。另外，冰藏期間，由于微生物和酶的作用，羅非魚體內(nèi)蛋白質(zhì)會逐漸降解變性，導(dǎo)致硫化氫、氨、甲硫醇、腐胺、尸胺、吲哚、四氫吡咯院等化合物的生成，導(dǎo)致顏色變暗并呈現(xiàn)異味；魚體之所以會變軟的原因主要有兩種說法：一種認為冷藏過程中，由于某種生化變化使結(jié)締組織的機械強度下降，導(dǎo)致魚肉軟化；也有人認為與肌原纖維的Z盤的脆弱化、肌動球蛋白復(fù)合體的解離、肌聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)變化或者結(jié)締組織的變性有關(guān)[2]。

3 結(jié)論

通過對冰藏條件下對羅非魚pH、肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)含量、Ca2+-ATPase活性、活性巰基含量、乳化性和感官品質(zhì)等理化特性影響的研究，發(fā)現(xiàn)羅非魚的pH在冰藏期間呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；肌原纖維蛋白溶出量則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；Ca2+-ATPase活性、巰基含量、乳化性以及感官評價均隨著貯藏時間的延長而逐漸降低；表面疏水性則隨著貯藏時間的延長而逐漸升高；通過感官評定發(fā)現(xiàn)貯藏前6d內(nèi)羅非魚的品質(zhì)一直處于一級鮮度的狀態(tài)，并且到第10d品質(zhì)仍保持新鮮，可以食用。

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