趙 欣，王 強，騫 宇，龐 諒

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067；2.釜山國立大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)科，釜山 609-735；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，重慶401147）

苦丁茶（Ilex kudingcha C.J.Tseng）是野生冬青科冬青屬苦丁茶種常綠喬木，俗稱茶丁、富丁茶、皋盧茶，是我國南方地區(qū)經(jīng)常飲用的一類茶，是傳統(tǒng)的藥用植物[1]?？喽〔枳鳛閭鹘y(tǒng)飲品和藥用植物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上具有清熱消暑、明目益智、生津止渴、利尿強心、潤喉止咳、降壓減肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脈等多種功效，是一種很好的醫(yī)藥保健飲料[2]?？喽〔柚泻胸S富的水浸出物、多酚類物質(zhì)、氨基酸、胡蘿卜素和維生素等，由于這些功能性成分的存在，在近年的研究中已經(jīng)表明，苦丁茶具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)心血管、生殖和免疫系統(tǒng)的功效[3-5]。此外，還有研究表明苦丁茶對胃癌患者化療后靜脈炎有預(yù)防和治療作用[6]，并且還可以誘導(dǎo)鼻咽癌細胞凋亡，起到抗癌效果[7]。近年關(guān)于茶葉在抗癌方面的研究已經(jīng)全面展開，其中關(guān)于苦丁茶抗癌研究也獲得了初步結(jié)果。為了進一步驗證苦丁茶的體外抗舌癌效果，本研究對苦丁茶進行了TCA8113人舌鱗癌細胞體外抗癌功能性的初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁茶 市售苦丁茶（海南產(chǎn)椰仙牌苦丁茶），為海南野生苦丁茶，在-50℃，2.0Pa下對其進行冷凍干燥后按茶水比1∶10，用沸水每次20min，3次反復(fù)提取后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后得到水提物，將提取物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后配制成20%的樣品溶液待用；TCA8113人舌鱗癌細胞（TCA8113 Human Tongue Squamous Carcinoma Cells）購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所；DMSO 日本純正化學(xué)株式會社；D-Biotin、L-histidine·HCI（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate（mono sodium salt）、NADP（sodium salt）、Paraformaldehyde、4，6-diamidino-2-phenylindole、ethidium bromide 美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)液、Fetal bovine serum（FBS）、0.05%trypsin-0.02%EDTA、100U/mL Penicillin-Streptomycin 美國GIBCO公司；Trizol reagent 美國Invitrogen公司；蛋白檢測試劑盒 美國Bio-Rad公司；western抗體 美國Santa Cruz公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-114 瑞士Buchi公司；恒溫水浴振蕩器HB-205SW 韓國Hanbeak科學(xué)株式會社；冷凍離心機VS-15CFN 韓國Vision科學(xué)株式會社；二氧化碳培養(yǎng)箱MC096 日本三洋電機株式會社；超凈工作臺HB-402V 韓國Hanbeak科學(xué)株式會社；倒置顯微鏡PM-1OAK、熒光顯微鏡BXS0 日本奧林巴斯株式會社；酶標(biāo)儀Elx800 美國Bio Tekinstruments公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法癌細胞體外增殖抑制實驗 將TCA8113人舌鱗癌細胞接種于含10%滅活小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周更換2～3次培養(yǎng)基，6～7d傳代一次。將培養(yǎng)的癌細胞按1×104個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180μL。5%CO2、37℃充分濕化條件下培養(yǎng)24h。細胞貼壁后按每孔20μL加入樣品?？變?nèi)實驗時，每個樣品設(shè)三個劑量組，分別為50、100、200μg/mL。48h培養(yǎng)后，每孔加入20μL MTT試劑（質(zhì)量濃度為5mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)4h，結(jié)束培養(yǎng)后吸棄孔內(nèi)上清液后，按每孔150μL加入DMSO后振蕩30min，540nm波長下用酶標(biāo)儀測定各孔OD值并計算細胞增殖抑制率。抑制率（%）=[（空白孔OD值一樣品孔OD值）/空白孔OD值]×100[8]。

1.2.2 DAPI熒光染色的癌細胞凋亡觀察 經(jīng)樣品處理后的癌細胞用PBS洗后用3.7%的多聚甲醛（Paraformaldehyde）常溫下固定細胞10min，然后用濃度為1μg/mL的熒光染料4，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI，Sigma公司）溶液染色10min。用PBS溶液漂洗染色后的細胞2次，熒光顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察并拍照[9]。

1.2.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析 同等條件下用RNAzol試劑制備TCA8113人舌鱗癌細胞總RNA。定量分離到RNA后，以oligo dT為引物，在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下制備ss cDNA，然后以該cDNA為模板，RT-PCR法擴增Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9基因。RT-PCR引物序列見表1，其中持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作為內(nèi)參照。實驗結(jié)束后，以1%瓊脂電泳（含濃度溴化乙錠）檢查PCR擴增產(chǎn)物[10]。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers of RT-PCR

1.2.4 Western blot分析 用RIPA細胞裂解液裂解細胞后，分離上清，用蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取30～50μg蛋白進行SDS-PAGE分離，電印跡至硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜上。將印跡的NC膜依次進行封閉、與Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9和GAPDH（Santa Cruz公司）的第一抗體、第二抗體結(jié)合，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁茶的體外抗癌作用實驗效果

采用MTT法，檢測苦丁茶的體外抗癌效果。如表2所示，苦丁茶水提取物對TCA8113人舌鱗癌細胞具有一定的抑制作用，且抑制效果隨樣品質(zhì)量濃度增加而增加。以200μg/mL濃度處理TCA8113人舌鱗癌細胞時，表現(xiàn)出很強的抑制率（75%）。以100、50μg/mL濃度處理TCA8113人舌鱗癌細胞時，癌細胞生長抑制率分別為41%和10%。由此可見，苦丁茶對TCA8113人舌鱗癌細胞具有增殖抑制效果，濃度較高時抑制效果更顯著。

表2 MTT法測定苦丁茶對TCA8113人舌鱗癌細胞的生長抑制率的影響（±s）Table 2 Inhibition of the growth of TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells by Ilex kudingcha C.J.Tseng as evaluated by a MTT assay（±s）

表2 MTT法測定苦丁茶對TCA8113人舌鱗癌細胞的生長抑制率的影響（±s）Table 2 Inhibition of the growth of TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells by Ilex kudingcha C.J.Tseng as evaluated by a MTT assay（±s）

組別OD540（樣品濃度，μg/mL）50 100 200抑制率（%）10±2 41±2 75±2

2.2 苦丁茶誘發(fā)癌細胞凋亡的效果

DAPI染色后，凋亡細胞核能發(fā)出藍色熒光，通過觀察細胞著色情況即可判定細胞是否凋亡。對照組TCA8113人舌鱗癌細胞染色后細胞核邊緣清晰，著色均勻。經(jīng)苦丁茶水提取物不同濃度（50、100、200μg/mL）處理后的TCA8113人舌鱗癌細胞均出現(xiàn)了細胞邊緣不規(guī)則、細胞核濃染、凋亡小體等典型的細胞凋亡現(xiàn)象，而其中以200μg/mL濃度作用下表現(xiàn)的最為明顯（見圖1）?？梢娍喽〔鑼φT導(dǎo)癌細胞凋亡具有很強的作用，且以200μg/mL濃度的作用效果明顯。

圖1 經(jīng)苦丁茶處理后TCA8113人舌鱗癌細胞的細胞凋亡情況Fig.1 Appearance of apoptotic body in TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells treated with Ilex kudingcha C.J.Tseng

2.3 苦丁茶葉對Bax、Bcl-2、caspases基因的mRNA、蛋白質(zhì)表達影響

苦丁茶水提取物以不同濃度處理TCA8113人舌鱗癌細胞，以200μg/mL濃度處理過的TCA8113人舌鱗癌細胞Bax、caspase-3、caspase-9表達最強，以100、50μg/mL質(zhì)量濃度處理過的TCA8113人舌鱗癌細胞中Bax、caspase-3、caspase-9表達呈現(xiàn)遞減的趨勢；Bal-2的mRNA表達中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度樣品處理后，隨著濃度的升高表達減弱。由此可以看出，在200μg/mL質(zhì)量濃度處理下苦丁茶對TCA8113人舌鱗癌細胞的凋亡作用強于其他濃度（見圖2）。

圖2 經(jīng)苦丁茶處理后TCA8113人舌鱗癌細胞的Bax、Bcl-2、caspases的mRNA、蛋白質(zhì)表達Fig.2 Effects of Ilex kudingcha C.J.Tseng on the mRNA and protein expression of Bax，Bcl-2 and caspases in TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells

3 結(jié)論與討論

對癌細胞增值的體外作用可以從一定程度上證明保健食品的癌預(yù)防效果。本文中隨著苦丁茶樣品濃度的增加，TCA8113人舌鱗癌細胞的增值減少，證明苦丁茶可以明顯地在體外抑制癌細胞的生長。細胞凋亡是在生理或病理條件下，由基因調(diào)控的細胞主動程序化死亡過程。在癌癥發(fā)生過程中凋亡相關(guān)基因的突變或表達異?？梢宰钄喟┘毎牡蛲?，促使癌癥發(fā)生[12]。Bcl-2基因是一種原癌基因，具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax相對量高于Bcl-2時，Bax同二聚體的數(shù)量增多，從而促進細胞死亡[13]。本研究中隨著處理癌細胞的苦丁茶濃度的增加，癌細胞的Bax表達加強，Bcl表達減弱，可以認為苦丁茶可以促進癌細胞的凋亡，從而起到對舌癌的預(yù)防作用。Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質(zhì)，從而造成細胞凋亡，caspase-9為凋亡途徑的上游caspase，caspase-3為下游caspase，caspase-9作為啟動性caspase，隨著表達的加強可以加強對下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡[14]。由此可以看出苦丁茶對癌細胞的caspase-3、caspase-9的作用可促進癌細胞凋亡?？喽〔韬锌扇苄蕴?、脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)，其中黃酮、γ-氨基酸和硒含量較高[15]。黃酮和硒都是有效的抗癌物質(zhì)，是苦丁茶具有較高抗癌效果的原因[16-17]。本文以市售苦丁茶為基準(zhǔn)進行了體外抗癌效能比較實驗，得出苦丁茶具有很強的體外抗癌效果的結(jié)果。苦丁茶對動物的抗癌效果和對人體的臨床作用也有待更深層次的研究。

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