高效液相色譜法快速測定紫貽貝中的?；撬?/h1>
2013-12-08 06:44:48鄭平安張春丹蘇秀榕
食品工業(yè)科技 2013年4期
張 亮，劉 文，鄭平安，黃 健，李 曄，張春丹，蘇秀榕，*
（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2.北京普析通用儀器有限責任公司，北京101200）
牛磺酸（Taurine），又稱β-氨基乙磺酸，是一種非蛋白結構的含硫氨基酸，在魚貝類尤其是軟體動物中含量十分豐富[1]。牛磺酸對人體起十分重要的生理調(diào)節(jié)功能，在促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育[2]、提高學習記憶能力[3]及延緩衰老[4]等方面具有重要調(diào)節(jié)作用，特別是對嬰幼兒的生長發(fā)育起著至關重要的作用[5-6]。據(jù)報道，貝類中馬氏珠母貝中?；撬岷扛哌_13830mg/kg[7]，牡蠣中牛磺酸含量至少也有8000mg/kg[1]，紫貽貝中?；撬岷肯鄬Φ鸵恍策_到4400mg/kg[1]。目前以上三種貝類的市場價格，馬氏珠母貝和牡蠣平均價分別為60元/kg和40元/kg，遠遠高于紫貽貝2元/kg這一低廉的價格?？梢?，紫貽貝作為一種廉價的?；撬醽碓从衅鋸V泛的市場價值。隨著?；撬嵫芯考皯玫难杆侔l(fā)展，?；撬岫繖z測的方法也急待建立和改進。目前?；撬岬臏y定方法主要有分光光度計法[8]、薄層層析法[9]、氨基酸自動分析法[10-11]和高效液相色譜法[12-13]等。隨著色譜技術的發(fā)展，高效液相色譜法因其樣品預處理簡單，方法準確度、精確度及靈敏度較高，在測定食品和生物組織中牛磺酸含量的應用中日益廣泛[14-16]。其中，柱前衍生高效液相色譜法是高效液相色譜法測定?；撬岜容^常用的方法之一[1]，只需在一般的HPLC儀器上使用普通的反相柱子就可以進行牛磺酸的測定。其中，鄰苯二甲醛（OPA）作為柱前衍生反應試劑在實際中應用較多[17-19]。而國內(nèi)目前利用OPA柱前衍生高效液相色譜法測定紫貽貝中?；撬釀t尚未見報道，章超樺等[20]利用氨基酸分析儀分析了翡翠貽貝游離氨基酸的組成及含量。本研究利用OPA柱前衍生—高效液相色譜法測定紫貽貝中的?；撬幔椒ê啽?、快速，為高效、準確的?；撬岱治黾捌浞椒ń⑻峁﹨⒖肌?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
紫貽貝（Mytilus edulisLinnaeus） 購于寧波市江北區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，開殼后取肉，勻漿、分裝，置-20℃冷凍備用；甲醇、乙腈 均為色譜純；?；撬針藴势访绹鳶igma公司；硼酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸 均為分析純；鄰苯二甲醛（OPA）、乙硫醇 均為化學純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液 稱取2.48g硼酸和1.41g氫氧化鈉，用水定容至100mL；衍生劑 稱取0.1g鄰苯二甲醛（OPA）用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。
1200型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax 300BC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱、G1321A熒光檢測器 美國Agilent公司；CQ25-12D超聲儀 寧波江南儀器廠。
1.2 實驗方法
1.2.1 樣品預處理 稱取紫貽貝3.0g，加10.0mL雙蒸水加熱煮沸10min，再超聲萃取15min，定容至50mL。充分混勻后，樣液于4000r/min離心10min，吸取2.0mL上述上清液于4mL離心管中，再加2.0mL 60g/L磺基水楊酸，離心10min，將此時的上清液轉移至10mL小燒杯中，滴加1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性，用水定容至25.0mL，待衍生用。
1.2.2 柱前衍生化反應 吸取1.0mL上述定容液于4mL離心管中，再準確加入1.0mL衍生劑搖勻，置暗處反應2min后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，立即進樣20μL，進行HPLC分析，測定其峰面積，所有試樣及標準溶液從反應至進樣的時間應保持一致，并控制在5min以內(nèi)。
1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇+乙腈+水（10∶10∶80，v/v/v）；流速0.8mL/min；進樣量：20μL；熒光檢測器（FLD）波長：Ex330nm，Em530nm；柱溫：30℃。
1.3 定量測定
標準曲線：用0.02mg/mL標準使用液配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/mL的?；撬針藴嗜芤?，對所得各濃度標準溶液衍生反應后進樣20μL進行測定。
采用外標定量。樣品中的?；撬岷扛鶕?jù)標準曲線方程進行計算。
1.4 回收率測定
在同一樣品中加入一定量的?；撬針藴势?，進樣測定，以考察方法的準確度。
2 結果與分析
2.1 ?；撬針藴是€繪制
根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針藴嗜芤旱某龇迕娣e，以牛磺酸質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線圖（見圖1）。?；撬針藴势飞V圖如圖2所示。
圖1 ?；撬針藴是€Fig.1 Standard curve of taurine
圖2 ?；撬針藴嗜芤荷V圖Fig.2 The HPLCchromatogram of taurine standard solution
由圖1可知，?；撬嵩?.0～20.0μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為：Y=45.954X+5.862，相關系數(shù)R2=0.9998。結果表明，?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。由圖2可知，?；撬岬谋Ａ魰r間為6.752min，出峰較快，為快速檢測提供了基礎。
2.2 回收率測定
同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針藴嗜芤哼M行測定，各加標量平行測定5次，利用差減法求出?；撬岬幕厥章剩ㄒ姳?）。結果表明，此方法的平均回收率為98.71%，相對標準偏差RSD=1.57%。
表1 回收率測定結果Table 1 Recovery test of samples
2.3 精密度測定
同一樣品重復測定6次，峰面積見表2，所測峰面積平均值為749.134±17.770，RSD為2.37%。
2.4 樣品的測定
按1.2.1和1.2.2方法處理樣品，三次平行樣測定結果及計算值見表3。由換算結果知，OPA柱前衍生高效液相色譜法測得該紫貽貝樣品中牛磺酸的平均質(zhì)量濃度為17.633μg/mL，換算到原料中?；撬岬钠骄|(zhì)量濃度為3673.631mg/kg。
表2 精密度測定結果Table 2 The result of precision test
表3 紫貽貝中?；撬岷縏able 3 The taurine content of Mytilus edulis Linnaeus
3 討論與結論
?；撬嵋杂坞x氨基酸的形式普遍存在于水產(chǎn)品的體內(nèi)組織和浸出液以及煮汁中[21]，化學性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于熱水中[22]。錢愛萍等[23]比較研究了6%磺基水楊酸熱水浴提取法、0.02mol/L鹽酸提取法、70%乙醇沸水浴提取法三種從海產(chǎn)品中提取?；撬岬那疤幚矸椒ǎY果顯示，用6%磺基水楊酸熱水浴法提取?；撬釡y定值最高。高加龍等[24]采用偏磷酸溶液溶解馬氏珠母貝肉，并經(jīng)超聲振蕩可進一步提取樣品中的牛磺酸。本實驗中的樣品預處理采用熱水浴結合超聲振蕩來提取紫貽貝中的牛磺酸，并選用60g/L磺基水楊酸作為沉淀劑來沉淀提取液中可溶性蛋白，去除蛋白的干擾。從樣品的測定結果來看，該樣品前處理方法可有效提取紫貽貝樣品中的?；撬幔也僮骱唵?，實驗中測得紫貽貝中?；撬岬暮客延形墨I[1]中報道紫貽貝中?；撬岬暮?400mg/kg較為接近。
使用OPA作為柱前衍生反應試劑的優(yōu)點在于它與?；撬嵫苌磻钑r間短，然而，由于其與?；撬嵘傻呐；撬嵫苌锓€(wěn)定時間較短，因此準確控制衍生反應時間是測定的關鍵?？刂品磻吝M樣的時間和操作的一致性，可排除衍生物穩(wěn)定時間短對測定結果的影響。
以甲醇∶乙腈∶水（10∶10∶80，v/v/v）為流動相，在激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長530nm條件下，平均回收率為98.71%，RSD為1.57%。OPA柱前衍生高效液相色譜法可快速測定紫貽貝中的牛磺酸，且只需要簡單的預處理就可以衍生上樣分析，并且分析時間短，線性好，靈敏度較高。
[1]譚樂義，章超樺，薛長湖，等.?；撬岬纳锘钚约捌湓诤Ｑ笊镏械姆植糩J].湛江海洋大學學報，2000（3）：75-79.
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（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2.北京普析通用儀器有限責任公司，北京101200）
牛磺酸（Taurine），又稱β-氨基乙磺酸，是一種非蛋白結構的含硫氨基酸，在魚貝類尤其是軟體動物中含量十分豐富[1]。牛磺酸對人體起十分重要的生理調(diào)節(jié)功能，在促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育[2]、提高學習記憶能力[3]及延緩衰老[4]等方面具有重要調(diào)節(jié)作用，特別是對嬰幼兒的生長發(fā)育起著至關重要的作用[5-6]。據(jù)報道，貝類中馬氏珠母貝中?；撬岷扛哌_13830mg/kg[7]，牡蠣中牛磺酸含量至少也有8000mg/kg[1]，紫貽貝中?；撬岷肯鄬Φ鸵恍策_到4400mg/kg[1]。目前以上三種貝類的市場價格，馬氏珠母貝和牡蠣平均價分別為60元/kg和40元/kg，遠遠高于紫貽貝2元/kg這一低廉的價格?？梢?，紫貽貝作為一種廉價的?；撬醽碓从衅鋸V泛的市場價值。隨著?；撬嵫芯考皯玫难杆侔l(fā)展，?；撬岫繖z測的方法也急待建立和改進。目前?；撬岬臏y定方法主要有分光光度計法[8]、薄層層析法[9]、氨基酸自動分析法[10-11]和高效液相色譜法[12-13]等。隨著色譜技術的發(fā)展，高效液相色譜法因其樣品預處理簡單，方法準確度、精確度及靈敏度較高，在測定食品和生物組織中牛磺酸含量的應用中日益廣泛[14-16]。其中，柱前衍生高效液相色譜法是高效液相色譜法測定?；撬岜容^常用的方法之一[1]，只需在一般的HPLC儀器上使用普通的反相柱子就可以進行牛磺酸的測定。其中，鄰苯二甲醛（OPA）作為柱前衍生反應試劑在實際中應用較多[17-19]。而國內(nèi)目前利用OPA柱前衍生高效液相色譜法測定紫貽貝中?；撬釀t尚未見報道，章超樺等[20]利用氨基酸分析儀分析了翡翠貽貝游離氨基酸的組成及含量。本研究利用OPA柱前衍生—高效液相色譜法測定紫貽貝中的?；撬幔椒ê啽?、快速，為高效、準確的?；撬岱治黾捌浞椒ń⑻峁﹨⒖肌?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
紫貽貝（Mytilus edulisLinnaeus） 購于寧波市江北區(qū)農(nóng)貿(mào)市場，開殼后取肉，勻漿、分裝，置-20℃冷凍備用；甲醇、乙腈 均為色譜純；?；撬針藴势访绹鳶igma公司；硼酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸 均為分析純；鄰苯二甲醛（OPA）、乙硫醇 均為化學純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液 稱取2.48g硼酸和1.41g氫氧化鈉，用水定容至100mL；衍生劑 稱取0.1g鄰苯二甲醛（OPA）用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。
1200型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax 300BC18（4.6mm×250mm，5μm）反相色譜柱、G1321A熒光檢測器 美國Agilent公司；CQ25-12D超聲儀 寧波江南儀器廠。
1.2 實驗方法
1.2.1 樣品預處理 稱取紫貽貝3.0g，加10.0mL雙蒸水加熱煮沸10min，再超聲萃取15min，定容至50mL。充分混勻后，樣液于4000r/min離心10min，吸取2.0mL上述上清液于4mL離心管中，再加2.0mL 60g/L磺基水楊酸，離心10min，將此時的上清液轉移至10mL小燒杯中，滴加1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至中性，用水定容至25.0mL，待衍生用。
1.2.2 柱前衍生化反應 吸取1.0mL上述定容液于4mL離心管中，再準確加入1.0mL衍生劑搖勻，置暗處反應2min后，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，立即進樣20μL，進行HPLC分析，測定其峰面積，所有試樣及標準溶液從反應至進樣的時間應保持一致，并控制在5min以內(nèi)。
1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax 300SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇+乙腈+水（10∶10∶80，v/v/v）；流速0.8mL/min；進樣量：20μL；熒光檢測器（FLD）波長：Ex330nm，Em530nm；柱溫：30℃。
1.3 定量測定
標準曲線：用0.02mg/mL標準使用液配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μg/mL的?；撬針藴嗜芤?，對所得各濃度標準溶液衍生反應后進樣20μL進行測定。
采用外標定量。樣品中的?；撬岷扛鶕?jù)標準曲線方程進行計算。
1.4 回收率測定
在同一樣品中加入一定量的?；撬針藴势?，進樣測定，以考察方法的準確度。
2 結果與分析
2.1 ?；撬針藴是€繪制
根據(jù)不同質(zhì)量濃度?；撬針藴嗜芤旱某龇迕娣e，以牛磺酸質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線圖（見圖1）。?；撬針藴势飞V圖如圖2所示。
圖1 ?；撬針藴是€Fig.1 Standard curve of taurine
圖2 ?；撬針藴嗜芤荷V圖Fig.2 The HPLCchromatogram of taurine standard solution
由圖1可知，?；撬嵩?.0～20.0μg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為：Y=45.954X+5.862，相關系數(shù)R2=0.9998。結果表明，?；撬嵩诖速|(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好。由圖2可知，?；撬岬谋Ａ魰r間為6.752min，出峰較快，為快速檢測提供了基礎。
2.2 回收率測定
同一樣品分別加入不同質(zhì)量濃度的?；撬針藴嗜芤哼M行測定，各加標量平行測定5次，利用差減法求出?；撬岬幕厥章剩ㄒ姳?）。結果表明，此方法的平均回收率為98.71%，相對標準偏差RSD=1.57%。
表1 回收率測定結果Table 1 Recovery test of samples
2.3 精密度測定
同一樣品重復測定6次，峰面積見表2，所測峰面積平均值為749.134±17.770，RSD為2.37%。
2.4 樣品的測定
按1.2.1和1.2.2方法處理樣品，三次平行樣測定結果及計算值見表3。由換算結果知，OPA柱前衍生高效液相色譜法測得該紫貽貝樣品中牛磺酸的平均質(zhì)量濃度為17.633μg/mL，換算到原料中?；撬岬钠骄|(zhì)量濃度為3673.631mg/kg。
表2 精密度測定結果Table 2 The result of precision test
表3 紫貽貝中?；撬岷縏able 3 The taurine content of Mytilus edulis Linnaeus
3 討論與結論
?；撬嵋杂坞x氨基酸的形式普遍存在于水產(chǎn)品的體內(nèi)組織和浸出液以及煮汁中[21]，化學性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于熱水中[22]。錢愛萍等[23]比較研究了6%磺基水楊酸熱水浴提取法、0.02mol/L鹽酸提取法、70%乙醇沸水浴提取法三種從海產(chǎn)品中提取?；撬岬那疤幚矸椒ǎY果顯示，用6%磺基水楊酸熱水浴法提取?；撬釡y定值最高。高加龍等[24]采用偏磷酸溶液溶解馬氏珠母貝肉，并經(jīng)超聲振蕩可進一步提取樣品中的牛磺酸。本實驗中的樣品預處理采用熱水浴結合超聲振蕩來提取紫貽貝中的牛磺酸，并選用60g/L磺基水楊酸作為沉淀劑來沉淀提取液中可溶性蛋白，去除蛋白的干擾。從樣品的測定結果來看，該樣品前處理方法可有效提取紫貽貝樣品中的?；撬幔也僮骱唵?，實驗中測得紫貽貝中?；撬岬暮客延形墨I[1]中報道紫貽貝中?；撬岬暮?400mg/kg較為接近。
使用OPA作為柱前衍生反應試劑的優(yōu)點在于它與?；撬嵫苌磻钑r間短，然而，由于其與?；撬嵘傻呐；撬嵫苌锓€(wěn)定時間較短，因此準確控制衍生反應時間是測定的關鍵?？刂品磻吝M樣的時間和操作的一致性，可排除衍生物穩(wěn)定時間短對測定結果的影響。
以甲醇∶乙腈∶水（10∶10∶80，v/v/v）為流動相，在激發(fā)波長330nm，發(fā)射波長530nm條件下，平均回收率為98.71%，RSD為1.57%。OPA柱前衍生高效液相色譜法可快速測定紫貽貝中的牛磺酸，且只需要簡單的預處理就可以衍生上樣分析，并且分析時間短，線性好，靈敏度較高。
[1]譚樂義，章超樺，薛長湖，等.?；撬岬纳锘钚约捌湓诤Ｑ笊镏械姆植糩J].湛江海洋大學學報，2000（3）：75-79.
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