江 豐，汪志慧，朱曉玲，嚴(yán) 恒，黃 茜，曹 暉

（1.湖北省商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究中心，湖北武漢 430010；2.武漢生物工程學(xué)院，湖北武漢 430415）

富馬酸二甲酯（Dimethyl fumarate，DMF），是美國20世紀(jì)80年代開發(fā)出來的一種新型防腐劑。由于DMF具有毒性低、抑菌能力強、抑菌種類多、不受環(huán)境影響等特點，在我國被廣泛應(yīng)用于食品、糧食、飼料等的防腐、防霉及保鮮[1-2]。DMF易水解生成甲醇，長期食用對肝、腎有很大的副作用，對人體尤其是兒童的成長發(fā)育危害很大[3]。我國衛(wèi)生部在2009年2月6日公布的食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單中明確規(guī)定DMF不允許在食品中使用，但一些不法經(jīng)營者仍違法將DMF用于食品的防腐[4]。目前衛(wèi)生部公布的DMF的檢測方法的檢測限高達(dá)25mg/kg，遠(yuǎn)不能滿足歐盟對產(chǎn)品中DMF的含量不應(yīng)超過0.1mg/kg的要求[5]，因此建立一種準(zhǔn)確、檢出限低的DMF的測定方法非常必要。目前DMF的檢測方法有薄層法[6]、液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]和氣相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法[15-16]法，但將超聲波輔助提取和氣相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜相結(jié)合檢測面包和餅干食品中DMF的方法未見報道。本文擬建立一種檢測限低、精密度好、回收率高的氣相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法來測定面包和餅干中DMF，為面包和餅干中DMF的檢測方法提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 SIGMA公司；丙酮、乙腈、三氯甲烷、乙酸乙酯 均為分析純；C18SPE小柱 安捷倫科技有限公司。

氣相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀TSQ Quantum XLS 賽默飛世爾科技；超聲洗滌儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.10g富馬酸二甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸乙酯溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，配制成1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。然后以乙酸乙酯逐級稀釋成0.001、0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.00μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作系列。

1.3 樣品處理

稱取2.00g粉碎樣品于10mL具塞試管中，加入10mL乙酸乙酯，超聲波提取25min，靜止10min后，將上清液用裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾至燒杯中，將濾液完全轉(zhuǎn)移至已用乙酸乙酯預(yù)淋過的C18SPE小柱中，再用5mL乙酸乙酯分兩次淋洗小柱，合并淋洗液，濃縮并定容至10mL，用GC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

色譜柱：TR-5 MS毛細(xì)管氣相色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；柱溫箱：70℃保持1min，以10℃/min的升溫速率升至150℃，再以25℃/min的升溫速率升至200℃，保持4min；進樣口溫度：220℃；進樣方式：不分流進樣；載氣流速：1.2mL/min；傳輸線溫度：230℃；進樣量：1μL；離子源：EI源；離子源溫度：230℃；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM）；掃描時間：4～6min；碰撞氣壓力：1.0mTorr；循環(huán)時間：0.3min。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 DMF總離子流色譜圖（0.050μg/mL）Fig.1 Total ion chromatogram of DMFstandard sample（0.050μg/mL）

圖2 DMF標(biāo)樣的一級質(zhì)譜圖（0.050μg/mL）Fig.2 The mass spectrum of standard DMF solution（0.050μg/mL）

2.1.1 富馬酸二甲酯的定性分析 通過全掃描方式觀察總離子流圖，得到目標(biāo)化合物的分子離子峰，在本方法的分析條件下，測得DMF特征色譜峰的保留時間為5.09min（見圖1）。對該色譜峰分析得到一級質(zhì)譜圖（見圖2），出現(xiàn)的特征性質(zhì)譜峰有：m/z59、85、113。與數(shù)據(jù)庫中DMF的質(zhì)譜圖基本吻合。

2.1.2 碰撞能量的優(yōu)化和特征離子的選擇 DMF在EI電離條件下，選定豐度值最大的m/z113碎片離子作為母離子，通過碰撞反應(yīng)進行離子掃描，逐步加大碰撞能量，母離子豐度逐漸減少，子離子豐度逐漸增加。選用豐度較大的兩個離子m/z85、59分別作為定量和輔助定性離子（見圖3），并確定最佳碰撞能量的范圍，最后在SRM模式下進一步調(diào)整碰撞能量，以獲得DMF的最大靈敏度。最終選擇的母離子、子離子和碰撞能量詳見表1。

圖3 DMF溶液的二級質(zhì)譜圖（0.050μg/mL）Fig.3 The second step mass spectrum of standard DMF solution（0.050μg/mL）

表1 檢測DMF的質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrum conditions for the detection DMF

2.2 提取條件的優(yōu)化

圖4 提取溶劑對回收率的影響（n=3）Fig.4 Effect of different solvents on the recovery rate（n=3）

2.2.1 提取溶劑的選擇 文獻(xiàn)[17]報道，丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈溶液均可作為面包和餅干中DMF的提取溶劑。為了進一步提高面包和餅干中DMF的回收率，在實驗過程了分別用丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈溶液對含0.020μg/mL DMF的餅干樣品進行提取，實驗結(jié)果如圖4所示。從圖4中可知，三氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈的回收率均較高，但從經(jīng)濟性、毒性等方面綜合考慮，最終選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。另外，由于樣液中含有一定量的油脂，所以有必要對樣品進行凈化處理。本實驗采用C18SPE小柱對油脂進行吸附，回收結(jié)果表明，利用C18SPE小柱凈化樣品可以在保證回收率的同時減少油脂對色譜柱的污染損壞。

2.2.2 超聲提取時間的選擇 用10mL乙酸乙酯溶液對含0.020μg/mL DMF的餅干樣品進行不同時間的超聲提取，從圖5可以看出，隨著時間的延長，回收率逐漸上升，25min后基本達(dá)到平穩(wěn)。這是因為DMF的擴散需要一定的時間，適當(dāng)延長超聲波提取時間，能使溶劑分布均勻；另外，提取過程中超聲波會產(chǎn)生一定的熱量[18]，這都將有利于回收率提高，但溫度過高會導(dǎo)致乙酸乙酯揮發(fā)，造成定量不準(zhǔn)確，綜合考慮以上因素，最終選擇的超聲提取時間為25min。

圖5 超聲提取時間對回收率的影響（n=3）Fig.5 Effect of ultrasound extracting time on the recovery rate（n=3）

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 重現(xiàn)性 在上述優(yōu)化條件下，分別將質(zhì)量濃度為0.005、0.010、0.050μg/mL的DMF標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣6次，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍分別為2.77%、1.11%和2.13%，結(jié)果表明，方法的重現(xiàn)性良好，能滿足檢測的要求。

2.3.2 方法的線性范圍 用乙酸乙酯配制DMF質(zhì)量濃度為0.001～1.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別進行測定。以峰面積y對相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（μg/mL）進行線性回歸，得到線性方程y=8.42134×106x+19364.4，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，且線性范圍廣。

以信噪比S/N=3時所對應(yīng)的DMF質(zhì)量濃度作為儀器檢測限，計算得到儀器檢測限為0.0005μg/mL；以取量2.0g計，本方法的檢出限為0.0025mg/kg。以10倍信噪比的方法計算本方法定量限為0.0075mg/kg，其值遠(yuǎn)低于衛(wèi)生部公布的DMF的檢測方法的檢測限（25mg/kg）。

2.3.3 實際樣品分析和回收率實驗 分別在空白樣品中加入不同量的DMF，混勻，按前述方法處理樣品，用GC-MS/MS測定，分別計算回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表2可見，方法的回收率為84.7%～99.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～3.61%。加標(biāo)樣品和面包樣品的二級總離子流色譜圖分別為圖6和圖7。

表2 DMF加標(biāo)回收率實驗（n=3）Table 2 Spike recovery test of DMF（n=3）

圖6 DMF加標(biāo)樣品的二級總離子流色譜圖（0.05mg/kg）Fig.6 The second step complete total ion chromatogram of DMF add standard sample（0.05mg/kg）

圖7 面包樣品的二級總離子流色譜圖Fig.7 The second step complete total ion chromatogram of bread

3 結(jié)論

本研究建立的測定面包和餅干中DMF含量的方法，采用了氣相色譜-三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）模式，經(jīng)碰撞能量優(yōu)化實驗，確定特征離子，獲得了極高的檢測靈敏度；同時分析了提取溶劑和超聲波提取時間對回收率的影響，最終確定提取溶劑為乙酸乙酯，超聲波提取時間為25min。經(jīng)過方法學(xué)驗證和實際樣品分析，相關(guān)線性、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均能取得很好的效果。本方法定量限為0.0075mg/kg，遠(yuǎn)低于衛(wèi)生部公布的DMF的檢測方法的檢測限（25mg/kg）。因此，本方法具有準(zhǔn)確、回收率高、檢出限低等優(yōu)勢，在定性和定量分析方面都能滿足面包和餅干中DMF的分析要求。

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