劉源，陳睿，張楠，葉賢龍，白銀，魏雨泉，任桂萍，李德山

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物制藥教研室，黑龍江 哈爾濱 150030

p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)性最高的基因，也是研究最為廣泛和系統(tǒng)的腫瘤抑制基因。人p53基因位于染色體 17p 13.1[1]區(qū)域，全長1 182 bp，由11個外顯子和10個內(nèi)含子組成，編碼分子量為53 kDa的核內(nèi)磷酸蛋白。正常的P53蛋白在體內(nèi)有拮抗因環(huán)境壓力造成的 DNA損傷、維持基因組穩(wěn)定的作用；對于可修復(fù)損傷，P53調(diào)控細胞周期暫時的釋放，以便于有足夠的時間進行修復(fù)，進而重新進入正常的細胞周期[2-5]；相反，嚴(yán)重的或者不可修復(fù)的DNA損傷將導(dǎo)致細胞凋亡；P53還有抑制腫瘤血管生成等功能[6-10]。

細胞穿膜肽 (Cell-penetrating peptides，CPPs) 是一類能攜帶大分子物質(zhì)進入細胞的短肽，其穿膜能力不依賴于經(jīng)典的胞吞作用[11]。CPPs根據(jù)來源可以分為天然存在的和人工合成的兩種，天然的穿膜肽來源于天然蛋白質(zhì)的多肽區(qū)域，主要負責(zé)將蛋白質(zhì)向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，包括TAT-PTD[12-13]、Penetration和 VP22[14]。這些細胞穿膜肽均為帶有正電荷的、長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基。利用這一特性，人工合成具有穿膜能力的多聚精氨酸和多聚賴氨酸的穿膜短肽，將生物分子帶入細胞內(nèi)發(fā)生作用，是一種細胞滲透性多肽，具有廣泛的組織相容性、穩(wěn)定性、低毒性和低免疫原性、具有特異的組織及細胞遞送功能、可人工合成及程序簡單等[15]優(yōu)點。其中 9個精氨酸 (9R)是一類含有大量正電荷的堿性氨基酸，其作為一個蛋白轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域來使用，它的堿性氨基酸殘基靠近細胞膜表面，然后CPPs發(fā)生旋轉(zhuǎn)使其疏水性氨基酸與細胞膜的疏水核心區(qū)相互作用，最后，細胞膜中的磷脂發(fā)生輕微斷裂，以使 CPPs穿透細胞膜[16]。

p53的基因產(chǎn)物是一種主要集中于核仁區(qū)、能與DNA特異結(jié)合、其活性受磷酸化調(diào)控且很容易降解，很容易因突變而喪失功能的蛋白。由于細胞膜的屏障，使得P53分子很難進入細胞，無法成為治療性蛋白藥物。本文將p53基因與穿膜肽9R基因融合于一體，表達可以穿透細胞膜P53融合蛋白，希望可以為腫瘤的生物治療提供一種新的策略。結(jié)果顯示帶有 9個精氨酸的CPPs-P53融合蛋白抑制腫瘤細胞生長的效果要明顯優(yōu)于沒有穿膜肽的P53。

1 材料與方法

1.1 材料

pHisSUMOexpression質(zhì)粒、pHisSUMO-9R expression質(zhì)粒、表達Escherichia coli菌株Rosetta (含DE3) 由本實驗室保存；人的外周血(志愿者提供)；HepG2細胞、U251細胞由本實驗室保存；Trizol購自Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自 Promega公司；PMD-18T-simplevector購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；新生牛血清購自Hyclone公司，Ni-NTA Agarose購自Sigma公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司；鼠抗人P53單克隆抗體 (D-07) 購自 DAKO公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自Bioscience公司；SUMO蛋白酶由本實驗室表達純化；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購自TIANGEN公司；所用的引物均由Invitrogen公司合成，引物見表1。

1.2 p53目的基因的獲得

采集志愿者的外周血，用Trizol提取人外周血的總RNA，并經(jīng)RT-PCR擴增出目的片段，PCR反應(yīng)體系為 1.0 μL cDNA 模板，2.5 μL 10×PCR緩沖液，2.0 μL dNTPs 混合液，0.5 μL rTaq聚合酶，2 μL PCR上下游引物 (10 mol/L)，滅菌三蒸水補足至25 μL。反應(yīng)條件為：95 5 min℃ ；95 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。每次擴增均設(shè)由三蒸水代替模板的空白對照。產(chǎn)物經(jīng) PCR純化后，連接到 PMD-18-T-simple載體，經(jīng)測序鑒定正確后，與NCBI上公布的人腫瘤蛋白p53(TP53) 基因的mRNA序列完全一致，分別用BsaⅠ和BamHⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，然后分別連接到pHisSUMO載體以及 pHisSUMO-9R載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta (DE3) 中進行表達。

1.3 目的蛋白的誘導(dǎo)表達

將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒 pHisSUMO-p53以及pHisSUMO-9R-p53的Rosetta (DE3) 劃線培養(yǎng)并挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)液中 (含100 mg/L氨芐青霉素) 振蕩培養(yǎng)過夜。將上述培養(yǎng)物按 1%的比例接種于LB培養(yǎng)液中 (含100 mg/L氨芐青霉素) 培養(yǎng)至OD值為0.3～0.4時，加入IPTG進行誘導(dǎo)表達。取不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)菌經(jīng)超聲破碎后離心，將沉淀部分加入與上清相同體積的無菌純水，取菌體、上清部分及沉淀部分進行SDS-PAGE，檢測融合蛋白的表達情況。

1.4 CPPs-P53融合蛋白以及P53蛋白的純化

取pHisSUMO-p53以及pHisSUMO-9R-p53轉(zhuǎn)化菌大量誘導(dǎo)表達CPPs-P53及P53蛋白。誘導(dǎo)后的菌體用溶解緩沖液 (10 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0)重懸后加入溶菌酶至終濃度為1 g/L，冰上放置30 min后超聲破碎，10 000×g、4 ℃離心 30 min，收集上清。上清利用AKTA purifier100系統(tǒng)經(jīng)過HisTrapTM FF crude親和層析，用洗滌緩沖液 (20 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0) 洗去雜蛋白后，再用洗脫緩沖液 (250 mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，pH 8.0) 洗脫，收集唯一的洗脫峰即為融合蛋白。收集的融合蛋白脫鹽后，加入SUMO蛋白酶和終濃度2 mmo l/L的DTT，30 ℃切割1 h，再經(jīng)Ni-NTA柱親和層析，收集流出液進行SDS-PAGE 電泳檢測。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 CPPs-P53以及 P53蛋白的 Western blotting印跡檢測

取純化的兩個重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入鼠抗人P53單克隆抗體 (1/50稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次5 min。再加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG (1/7 500稀釋)，37 ℃溫育1 h，PBST和PBS各洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，同時以BSA作為對照。

1.6 CPPs-P53以及P53對HepG2和U251細胞生長的抑制試驗

取對數(shù)生長期人肝癌 HepG2細胞及腦膠質(zhì)瘤細胞U251，經(jīng)0.25%胰酶消化后，用含10%小牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞密度為1×105/mL，并接種于 96孔細胞培養(yǎng)板上，每孔100 μL。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后吸去上層培養(yǎng)液，將純化后CPPs-P53以及P53蛋白稀釋至1 mg/mL，并以此濃度為起始濃度按1∶2倍比稀釋后加入各孔，每孔 200 μL，每個濃度梯度各設(shè)5個復(fù)孔，共設(shè)置7個稀釋度。設(shè)只加入培養(yǎng)液的空白對照及不孵育蛋白的細胞為陰性對照。培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加20 μL MTT (5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)液，向每孔加入150 μL二甲亞砜溶解甲瓚，振蕩10 min后檢測A570，以空白組平均值調(diào)零，按以下公式計算抑制率：

細胞生長抑制率=正常細胞孔平均OD值/對照孔平均OD值?實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值

1.7 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡

將HepG2及U251細胞懸液接種6孔細胞培養(yǎng)板，每孔加2 mL，置37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，根據(jù)MTT結(jié)果，細胞完全貼壁后換濃度為0.25 mg/mL的CPPs-P53和P53的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后，用0.25%的胰酶消化細胞 (0.5×106～1×106)，用 PBS 洗 2 次，加入 500 mL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入 FITC標(biāo)記的 5 μL Annexin-V，混勻避光反應(yīng) 30 min，再加入 5 μL PI和300 μL結(jié)合緩沖液，避光反應(yīng)5～15 min后，立即用流式細胞術(shù)定量檢測 (一般不超過1 h)，同時以不孵育蛋白的細胞一管作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 p53基因的獲得

從人外周血中提取的 RNA樣品通過 1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。從電泳圖中可以清楚地看到28 S，18 S和5 S三條帶，表明總RNA完整性較好，提取的總RNAOD260/OD280分布在1.8～2.0之間，表明質(zhì)量較好 (圖1)。質(zhì)粒經(jīng)PCR后，得到了與預(yù)期結(jié)果1 182 bp大小相同的條帶(圖2)。測序結(jié)果經(jīng)過NCBI上blast比對，與突變株TP53 (GenBank Accession No. NM_000546)同源性達到100%，證明p53目的基因已經(jīng)克隆成功。

圖1 人外周血總RNAFig. 1 Total RNA of human peripheral blood. M: DNA marker; 1?3: total RNA.

圖2 目的基因的克隆Fig. 2 Amplification of p53 and CPPs-p53 by PCR. M:DNA marker; 1: p53; 2: CPPs-p53; 3: negative control.

2.2 CPPs-P53重組蛋白的制備及鑒定

將獲得p53基因成功地插入高效原核表達系統(tǒng)pHisSUMO-9R載體以及pHisSUMO載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，成功表達 CPPs-P53融合蛋白以及P53蛋白，兩種重組蛋白在37 ℃時，選取0.25 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達，取不同誘導(dǎo)時間的誘導(dǎo)菌進行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，獲得與預(yù)期的蛋白分子量 (約 66 kDa) 大小相一致的CPPs-P53以及P53，但兩種目的蛋白均以包涵體的形式表達。改變誘導(dǎo)溫度為20 ℃，摸索誘導(dǎo)劑IPTG (0.1～1.0 mmol/L) 在不同濃度下的誘導(dǎo)情況。經(jīng)灰度掃描分析，結(jié)果顯示融合蛋白CPPs-P53以包涵體的形式表達 (圖3)，目的蛋白P53 90%以上以可溶形式存在 (圖 4)。利用pHisSUMO載體表達外源蛋白時，融合蛋白N端含有6×His標(biāo)簽，可以利用Ni-NTA層析柱進行純化。CPPs-P53表達菌破碎后離心的沉淀經(jīng)包涵體變性復(fù)性以及透析等技術(shù)得到 SUMOCPPs-P53蛋白；P53表達菌破碎后上清經(jīng)親和層析得到唯一的洗脫峰即為SUMO-P53融合蛋白。融合蛋白經(jīng)SUMO ProteaseⅠ酶切并純化后獲得成熟CPPs-P53融合蛋白和P53蛋白 (圖5、6)。經(jīng)Western blotting印跡分析表明，這兩個成熟蛋白均可與鼠抗人 P53的單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，而與其他蛋白無反應(yīng)，證實了所表達的蛋白的特異性(圖7)。

圖3 目的蛋白pSUMO-P53的表達Fig. 3 SDS-PAGE analysis of expression of SUMO-P53. M: marker; 1: negative control; 2?8:soluble after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h; 3?9:inclusion after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h.

圖4 目的蛋白SUMO-CPPs-P53的表達Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression of SUMO-CPPs-P53. M: marker; 1: negative control; 2?8:soluble after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h; 3?9:inclusion after IPTG induct 1 h, 2 h, 3 h, 4 h.

2.3 重組CPPs-P53能更有效抑制腫瘤細胞的生長

將HepG2細胞和U251細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)24 h，吸去上層培養(yǎng)液。將純化后的兩種重組蛋白均稀釋至1 mg/mL，并以此濃度為起始濃度按 1∶2倍比稀釋后加入各孔，每個稀釋度5個復(fù)孔，同時設(shè)不加任何蛋白孵育的細胞為陰性對照組；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后測定吸光度并計算細胞生長抑制率。以各孔所加蛋白濃度的稀釋度為橫坐標(biāo)，以細胞生長抑制率為縱坐標(biāo)作圖 (圖 8、9)，從中可以看出 P53蛋白對 HepG2和U251的細胞生長均有一定的抑制作用，而融合蛋白CPPs-P53對HepG2和U251的細胞生長的抑制作用更加顯著，并呈現(xiàn)劑量依賴性。CPPs-P53處理的HepG2細胞的MTT檢測結(jié)果顯示，其細胞生長抑制率比P53高2～8倍。CPPs-P53蛋白對于 U251細胞的 MTT檢測結(jié)果顯示，其抑制率比P53高1～2倍。生物統(tǒng)計學(xué)分析顯示，CPPs-P53融合蛋白與 P53相比對腫瘤細胞的抑制效果更好，差異極顯著 (*P<0.05；**P<0.01)。由此推斷9個精氨酸的穿膜肽能攜帶P53蛋白進入細胞內(nèi)并更好地抑制癌細胞的生長。

圖5 成熟CPPs-P53融合蛋白的制備Fig. 5 Mature CPPs-P53 fusion protein. M: marker; 1:mature CPPs-P53 protein; 2: fusion protein after Protease cleavage.

圖6 成熟P53蛋白的制備Fig. 6 Mature P53 protein. M: marker; 1: fusion protein after Protease cleavage; 2, 3: mature P53 protein.

圖7 CPPs-P53及P53的Western blotting分析Fig. 7 Western blotting analysis of the recombinant CPPs-P53 and P53. 1: BSA; 2: P53; 3: CPPs-P53.

圖8 目的蛋白作用于HepG2細胞的MTT檢測結(jié)果Fig. 8 MTT assay of HepG2 treated with target protein.

細胞生長抑制率=正常細胞孔平均OD值/對照孔平均OD值?實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值

圖9 目的蛋白作用于U251細胞的MTT檢測結(jié)果Fig. 9 MTT assay of U251 treated with target protein.

2.4 重組 CPPs-P53更有效地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡

將HepG2及U251接種于6孔細胞培養(yǎng)板，細胞完全貼壁后更換含P53和CPPs-P53的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)36 h后消化細胞，經(jīng)FITC標(biāo)記的Annexin-V和PI處理過的細胞用流式細胞儀檢測細胞的凋亡，結(jié)果見圖10。圖中Q1門為壞死的細胞，Q2門為晚期凋亡的細胞，Q3門為正常細胞，Q4門為早期凋亡的細胞。圖10A為HepG2空白對照的檢測結(jié)果，晚期凋亡細胞約占3.1%，早期凋亡細胞約為3.2%。圖10B為加入P53蛋白的檢測結(jié)果，晚期凋亡細胞約占 8.2%，早期凋亡細胞約為2.3%。圖10C為加入CPPs-P53融合蛋白的檢測結(jié)果，晚期凋亡細胞約占21.1%，早期凋亡細胞約為1.7%。如圖10A-C所示，與P53相比，CPPs-P53誘導(dǎo) HepG2細胞發(fā)生凋亡的效果更為顯著，晚期凋亡效果尤其顯著，凋亡率提高了12.9%。圖10D為U251空白對照的檢測結(jié)果，晚期凋亡細胞約占 4.8%，早期凋亡細胞約為0.6%。圖10E為加入P53蛋白的細胞檢測結(jié)果，晚期凋亡細胞約占 5.4%，早期凋亡細胞約為1.9%。圖10F為加入CPPs-P53融合蛋白的檢測結(jié)果，晚期凋亡細胞約占14.0%，早期凋亡細胞約為3.1%。如圖10D-F所示，與P53相比，CPPs-P53誘導(dǎo) U251細胞發(fā)生凋亡的效果更為顯著，晚期凋亡的效果顯著，凋亡率提高了8.6%。由此推斷CPPs-P53中的9個精氨酸的穿膜肽能有效攜帶P53蛋白進入細胞內(nèi)，顯著提高了HepG2和U251細胞的凋亡。

3 討論

目前已經(jīng)成藥并應(yīng)用于疾病治療的生物大分子藥物主要有酶、激素、細胞因子以及抗體等，它們或是直接發(fā)揮作用，或是通過細胞膜表面受體發(fā)揮效應(yīng)。而像P53一類的信號傳導(dǎo)蛋白卻因為細胞膜的天然屏障而久久不能得以應(yīng)用，此類蛋白若不能進入細胞，就很容易在機體內(nèi)發(fā)生降解，難以發(fā)揮高效、穩(wěn)定的生物學(xué)作用[17]，細胞穿膜肽的出現(xiàn)有望化解這一瓶頸，為多種蛋白分子成藥提供了新的途徑。細胞穿膜肽作為一種具有高效穿膜活性的非病毒載體，不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，而且可以攜帶各種大分子物質(zhì)進入細胞內(nèi)，并保持其生物活性，具有廣闊的應(yīng)用前景。而9個精氨酸構(gòu)成的穿膜肽保證了穿膜所需的最大的內(nèi)在化作用，同時其肽分子較短，更有利于其與攜帶的生物分子融合表達[18]。

圖10 P53以及CPPs-P53作用HepG2、U251細胞Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率Fig. 10 Apoptotic analyses of HepG2 and U251 treated with P53 and CPPs-P53 by Annexin-V-FITC/PI method. (A)HepG2 blank contrast. (B) Apoptosis of HepG2 treated with P53. (C) Apoptosis of HepG2 treated with CPPs-P53. (D)U251 blank contrast. (E) Apoptosis of U251treated with P53. (F) Apoptosis of U251treated with CPPs-P53.

隨著惡性腫瘤的發(fā)生率越來越高，人們一直在尋求一種有效的治療手段。腫瘤的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中包括各種基因的調(diào)節(jié)作用，原癌基因的激活以及抑癌基因的失活等，而p53基因是目前研究最廣泛而深入的抑癌基因，在細胞受到損害導(dǎo)致 DNA斷裂時，P53蛋白可作用于不同層面引起細胞周期阻滯、凋亡或衰老，保持細胞基因組的完整性并清除損傷細胞，其作用途徑包括誘導(dǎo)多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄或通過非轉(zhuǎn)錄依賴的機制發(fā)揮作用[19]。一旦p53基因缺失或突變失活，則將導(dǎo)致細胞惡性轉(zhuǎn)化、無限制增殖從而引發(fā)癌癥，因此如果將P53蛋白導(dǎo)入腫瘤細胞就能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用[20]。

P53蛋白本身就是核內(nèi)磷酸化蛋白，必須進入到核內(nèi)才能發(fā)揮其功能，因此將P53蛋白帶到細胞內(nèi)部成為首要解決的問題。本實驗成功構(gòu)建質(zhì)粒 pHisSUMO-p53以及 pHisSUMO-9R-p53，并在E. coli表達系統(tǒng)中大量表達，純化獲得了重組的P53及CPPs-P53蛋白。通過Western blotting檢測顯示表達的蛋白分子量正確，經(jīng)灰度分析表明蛋白純度均高于 90%以上。MTT及 Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡的實驗中，MTT檢測表明重組 P53對腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用，CPPs-P53與 P53相比，對腫瘤細胞的生長抑制效果更加顯著，并且細胞生長抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性。MTT檢測結(jié)果顯示，CPPs-P53對HepG2細胞的生長抑制效果尤為突出，細胞生長的抑制率可高達P53的8倍，對U251的抑制率也達到了P53的2倍。AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡的結(jié)果表明 P53可以在一定程度上誘導(dǎo)細胞的凋亡，CPPs-P53與 P53相比，細胞凋亡率明顯增加，對于HepG2和U251兩種細胞的凋亡率均提高了 2～3倍?？傊?R攜帶的 P53(CPPs-P53) 在抑制腫瘤細胞的生長方面比沒有穿膜肽的P53蛋白效果更顯著，同時也驗證了9個精氨酸確實有攜帶P53進入細胞的作用。

現(xiàn)如今，生物大分子治療疾病的報道如雨后春筍般涌現(xiàn)，各種藥物載體之間的聯(lián)合使用、與高分子聚合物的結(jié)合，在腫瘤靶向治療[21]、基因治療、增強藥物吸收、建立新型給藥方式及炎癥免疫治療等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有9R攜帶P53融合蛋白治療癌癥的報道。雖有表達PTD-P53及11R-P53融合蛋白的研究，但報道的內(nèi)容均局限于細胞穿膜肽可以將蛋白分子帶入細胞內(nèi)部的驗證。本實驗報道了9個精氨酸攜帶的P53蛋白對于腫瘤細胞的生長存在抑制作用并能高效誘導(dǎo)細胞凋亡。對于依賴于病毒載體的基因治療，可以將 9R-P53插入病毒表達載體中，以融瘤的方式治療癌癥；對于不依賴于病毒載體的基因治療，可以通過表達能穿透細胞膜的重組的融合蛋白進行基因調(diào)控治療癌癥。本實驗驗證了帶有9R穿膜肽的P53的抗腫瘤效果，為進一步研究P53在細胞內(nèi)的作用機制，應(yīng)用P53蛋白進行腫瘤的生物治療提供了一種新的思路和策略，為開辟腫瘤治療新途徑奠定了重要基礎(chǔ)。

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