嚴濤，趙錦芳，高文慧，王金華，王永澤，趙筱，周勝德

工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430068

在底物為六碳糖和五碳糖的情況下，大腸桿菌會優(yōu)先利用速效碳源 (即六碳糖)，然后再利用遲效碳源 (即五碳糖)，這種現(xiàn)象稱為碳代謝產(chǎn)物抑制 (CCR)[1]，這是由于相關(guān)酶的活動和基因表達的情況下，抑制了細胞運輸其他碳源的能力[2-4]。所有的這些現(xiàn)象與磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS)密切相關(guān)[5]，此系統(tǒng)對于菌體具有以下生理學(xué)意義：碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、分解物代謝阻遏、碳源儲備、協(xié)調(diào)碳氮代謝平衡等[6]。PTS系統(tǒng)包括EI、HPr以及EIIs，前兩者為胞質(zhì)可溶型蛋白，分別由pts H和ptsⅠ編碼，后者多為蛋白復(fù)合體，對碳水化合物具有特異性，包括EIIMan、EIIFru、EIIBgl、EIIAGlc、EIICBGlc等[6]，其中crr基因編碼的EIIAGlc以及ptsG基因編碼的EIICBGlc在葡萄糖磷酸化轉(zhuǎn)運中起主要作用[7]，其中由ptsG基因編碼的酶EIICBGlc在葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)動中具有重要作用[8]。

關(guān)于ptsG基因缺陷菌株與大腸桿菌Escherichia coli發(fā)酵的研究在國內(nèi)也有相關(guān)報道[9]，Li等[1]構(gòu)建了大腸桿菌PTS缺陷株，即敲除ptsG基因，使大腸桿菌同時能利用混合糖發(fā)酵來生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯 (PHAs)；韓聰?shù)萚10]以Escherichia coliDH5α、JM109為出發(fā)菌株，在重組酶的作用下，構(gòu)建ptsG基因缺陷株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺陷菌株的最高菌密度遠高于對照菌株。重組蛋白腫瘤壞死因子 (TNF) 在缺陷菌株中的表達量占到全菌蛋白的 20.8%～24.3%，說明ptsG基因缺陷株具有良好的生長能力和表達外源蛋白的能力，在大腸桿菌高密度發(fā)酵[11-13]研究方面具有巨大的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有的一些發(fā)酵菌種可利用碳源的范圍比較窄 (如運動發(fā)酵單胞菌只能以葡萄糖、蔗糖或果糖作為發(fā)酵原料；釀酒酵母也只能利用六碳糖，不能利用五碳糖)，而大腸桿菌雖然可利用的碳源范圍較廣 (可以利用五碳糖和六碳糖)，但是在五碳糖和六碳糖同時存在的情況下，由于碳代謝產(chǎn)物抑制，大腸桿菌是先利用完葡萄糖，再利用木糖的，木糖的消耗量不大。為了提高糖的消耗量，提高乙醇產(chǎn)量，文中采用遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速的工程菌大腸桿菌SZ470為菌株，利用Red同源重組技術(shù)[14]構(gòu)建ptsG基因缺陷株，有望降低葡萄糖的攝取速率，減少副產(chǎn)物累積，解除葡萄糖效應(yīng)，促進菌體生長，使其在混合糖 (即五碳糖和六碳糖) 培養(yǎng)基中能同時利用五碳糖和六碳糖，擴大大腸桿菌底物同時利用糖的范圍，增加糖的消耗量，提高乙醇的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

Escherichia coliSZ470為本實驗室構(gòu)建的高效同型乙醇發(fā)酵工程株，來源于野生菌株E. coliB，其丙酮酸甲酸裂解酶 (focA-p fl B)、延胡索酸還原酶 (frdABCD)、乙酸激酶 (ackA)、D-乳酸脫氫酶 (ldhA) 4個基因被敲除，并通過無氧啟動子融合表達技術(shù)倍增了 NADH還原力，是一株優(yōu)秀的厭氧同型乙醇發(fā)酵菌株[15-17]，該菌株由于敲除了ldhA、frdABCD、p fl B、ackA等基因，因此減少或消除了其他副產(chǎn)物，使其葡萄糖的代謝產(chǎn)物主要只有乙醇。質(zhì)粒pKD46 (溫度敏感型復(fù)制子，Ampr)、質(zhì)粒pKD4 (含有卡那霉素的抗性基因Kanr) 和抗性基因消除質(zhì)粒 pCP20為本實驗室保存[18]。

1.1.2 引物

擴增卡那霉素抗性基因的引物P1、P2分別由兩部分組成 (表1)，靠近5端未加下劃線的序列與ptsG基因兩翼序列同源，靠近 3端加下劃線的序列與質(zhì)粒pKD4上Kanr基因兩側(cè)序列互補。采用 Red同源重組技術(shù)[14](它是一段兩側(cè)40～60 bp，與目標基因同源的序列，利用Red重組酶，將它導(dǎo)入菌體細胞中，使擴增的DNA片段與染色體的特定目標序列進行同源重組，目標基因被標記基因替換下來的一種基因工程敲除手段) 使其與目標基因互換。在大腸桿菌染色體上ptsG基因外側(cè)和內(nèi)側(cè)，分別設(shè)計兩對引物P3、P4和P5、P6用于敲除后重組菌株的驗證。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.1.3 主要試劑和儀器

DNATaq聚合酶購自Fermentas公司。L-阿拉伯糖為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。蛋白胨和酵母粉為英國Oxoid公司產(chǎn)品。氨芐青霉素和卡那霉素均購自 Mersco公司，工作濃度分別為100 mg/L和50 mg/L。其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。電擊轉(zhuǎn)化儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

表1 敲除和鑒定ptsG基因的引物Table 1 Primers for deletion and identification of ptsG

1.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基加5%的葡萄糖 (LB+5% G)、LB培養(yǎng)基加2.5%的葡萄糖和2.5%的木糖 (LB+2.5% G+2.5% X，即混合培養(yǎng)基)。

1.2 方法

1.2.1 PCR片段的制備

以質(zhì)粒 pKD4為模板，P1和 P2為引物，進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，溶于去離子水中，得到兩端帶有ptsG同源臂的卡那霉素抗性基因片段。

1.2.2 pts G基因敲除

用CaCl2法將pKD46轉(zhuǎn)化到E. coliSZ470細胞中，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選后得到陽性菌落。挑取大腸桿菌SZ470/pKD46的單菌落接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，加入2% L-阿拉伯糖30 ℃培養(yǎng)至OD600=0.5～0.6，將菌液置冰浴中 15 min后10 000 r/min離心10 min，所得細胞用去離子水反復(fù)洗滌3次后。將上述PCR擴增產(chǎn)物與EP管中的細胞混合，1 500 V電擊后立刻加入1 mL預(yù)冷的LB+50% G的培養(yǎng)基中，于搖床中30 ℃、150 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)2 h，涂布于含有卡那霉素的抗性平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 重組菌株的鑒定及抗性基因的消除

挑取在卡那霉素抗性平板上生長良好的陽性轉(zhuǎn)化子單菌落，以 P3、P4和 P5、P6為引物進行 PCR擴增，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物大小，以E. coliSZ470為對照菌株。將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已成功敲除ptsG基因的卡那霉素抗性陽性菌株，30 ℃培養(yǎng)3 h后，涂于無抗性平板上，42 ℃過夜培養(yǎng)，熱誘導(dǎo)促進FLP重組酶表達，同時質(zhì)粒也逐漸丟失。挑取在無抗性平板上生長良好而在抗性平板上不能生長的重組菌菌落，轉(zhuǎn)接3次。

1.2.4 五碳糖發(fā)酵培養(yǎng)

挑取敲除成功的重組菌株、對照菌株的單菌落接種于裝有100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，37 ℃培養(yǎng) 10 h后，分別接種于裝有100 mL LB+5% G和LB+2.5% G+2.5% X培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)，定時取樣，測定菌體光密度OD600值、糖濃度及乙醇產(chǎn)量。每個處理做3個平行。

1.2.5 發(fā)酵產(chǎn)物檢測分析

光密度OD600值用紫外分光光度計在600 nm處測定，葡萄糖和木糖的濃度用安捷倫的1 200型高效液相色譜儀檢測，檢測條件：采用示差檢測器，柱子型號為 BioRad公司的 HPX87H，柱溫 35 ℃，流動相為 4 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，進樣 20 μL；乙醇采用氣相色譜儀進行測定，測定條件：采用氫離子火焰檢測器(FID)，毛細管柱，柱溫40 ℃，進樣溫度200 ℃，檢測器溫度200 ℃，載氣為氮氣，流速2 mL/min，正丙醇作為內(nèi)標，進樣0.5 μL。乙醇理論產(chǎn)量的計算為消耗1 mol葡萄糖可產(chǎn)生2 mol乙醇，消耗1.2 mol木糖可產(chǎn)生2 mol乙醇。根據(jù)消耗的糖的量來計算實際產(chǎn)乙醇的量。

2 結(jié)果

2.1 PCR片段的制備

以 pKD4為模板，P1和 P2為引物，擴增出兩端與ptsG基因上下游序列同源，中間為卡那霉素抗性基因Kanr的 DNA片段，經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小約為1 550 bp，與理論值基本一致 (圖1)。

圖1 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 1 Electrophoresis analysis of PCR product. 1:DNA marker; 2: PCR product.

2.2 ptsG基因缺陷株的鑒定

挑取卡那平板上篩選得到的轉(zhuǎn)化菌株單菌落，以P3和P4為引物，進行PCR擴增，電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。結(jié)果如圖2A所示，ptsG基因自身長度為1 434 bp，電擊轉(zhuǎn)化后，卡那霉素抗性基因重組到SZ470染色體上，擴增的片段長度約為1 550 bp，而兩者相差100 bp左右；以P5、P6為引物，按上述步驟進行再 PCR擴增，由于引物 P5、P6是在ptsG基因內(nèi)部設(shè)計的，所以如果敲除成功，重組菌株不會出現(xiàn)相應(yīng)的擴增條帶，而對照菌株會出現(xiàn)約786 bp大小的基因片段(圖2B)。通過兩次PCR驗證實驗，可以證明ptsG基因成功敲除，將敲除成功的菌落經(jīng)過42 ℃熱誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其卡那霉素抗性基因消除掉，將該鑒定成功敲除ptsG基因的重組菌株命名為Escherichia coliSZ470P，用于后續(xù)搖瓶發(fā)酵實驗，以進一步驗證預(yù)期的結(jié)果。

圖2 ptsG基因缺陷株的PCR鑒定Fig. 2 Identification of ptsG mutants by PCR. (A) PCR was performed with the primers P3 and P4. (B) PCR was performed with the primers P5 and P6. 1, 4: DNA marker; 2, 6: SZ470P; 3, 5: SZ470.

2.3 重組菌株生長曲線

以在培養(yǎng)基中各時刻所測定的菌體吸光度對發(fā)酵時間作圖，從圖3可以看出，在LB+5% G的培養(yǎng)基中，ptsG缺陷菌株 SZ470P在發(fā)酵0～48 h，缺陷菌株OD600值小于對照組；發(fā)酵48 h后，缺陷菌株 SZ470P的OD600值超過了對照菌株，在72 h達到最大OD600值為10.65，是對照菌株的1.15倍，對照菌株最高OD600值為9.24。

在LB+2.5% G+2.5% X培養(yǎng)基中，ptsG缺陷菌株最大OD600值 (9.57) 稍高于對照菌株最大OD600值 (9.27)。以上結(jié)果表明，與對照菌株相比，大腸桿菌ptsG缺陷株可攝取更多的還原糖用于菌體生長，因而具有較高的生物量。

2.4 重組菌株還原糖消耗曲線

由于敲除了ptsG基因，ptsG基因缺陷菌株SZ470P的葡萄糖消耗量就不及對照菌株SZ470，如圖4A所示，在LB+5% G的培養(yǎng)基中，缺陷菌株SZ470P葡萄糖的消耗速率明顯低于對照菌株，其葡萄糖消耗速率 (1.08 g/(L?h)) 是對照菌株 (2.08 g/(L?h)) 的一半。發(fā)酵到最后，對照菌株消耗了39 g/L的葡萄糖，而缺陷菌株只消耗了大約40%的葡萄糖，即消耗了20 g/L。

從圖4B中可以看到，對照菌株SZ470是先利用完葡萄糖再利用木糖的，即在發(fā)酵36 h時消耗完葡萄糖之后，再開始消耗木糖，葡萄糖的消耗速率達到了1 g/(L?h)，而木糖的消耗速率僅為0.17 g/(L?h)，這是因為葡萄糖和木糖同時存在的情況下，葡萄糖會產(chǎn)生抑制效應(yīng)。而缺陷菌株SZ470P培養(yǎng)基中的木糖和葡萄糖的消耗曲線是同時下降的，其中木糖的消耗速率 (0.64 g/(L?h))比葡萄糖 (0.5 g/(L?h)) 的快。如圖4B所示，發(fā)酵到96 h時，對照菌株葡萄糖全部消耗完，木糖只消耗了 5 g/L；而缺陷菌株 SZ470P消耗了13 g/L的葡萄糖和 20 g/L的木糖。缺陷菌株SZ470P的木糖消耗量是對照菌株的 4倍。可能是因為敲除了ptsG基因之后，大腸桿菌減少了對葡萄糖的攝取率，減弱了葡萄糖抑制效應(yīng)，使大腸桿菌能同時利用葡萄糖和木糖，增加了木糖的消耗量。

圖3 大腸桿菌ptsG缺陷株在LB+5% 葡萄糖及混合糖培養(yǎng)基中的生長情況Fig. 3 Comparison of growth between parent and ptsG mutant strains in LB+5% glucose and sugar mixture medium.

2.5 乙醇產(chǎn)量

圖4 大腸桿菌ptsG缺陷株和對照菌株對葡萄糖和木糖的利用Fig. 4 Sugar consumption of E. coli SZ470P (ptsG?)and E. coli SZ470 (ptsG+). (A) Fermentation in 5%glucose. (B) Fermentation in 2.5% glucose+2.5%xylose.

大腸桿菌缺陷菌株SZ470P與對照組SZ470的發(fā)酵乙醇產(chǎn)量如圖 5所示，缺陷菌株 SZ470P在LB+5% G的培養(yǎng)基中的乙醇產(chǎn)量不高，因為其被敲除了ptsG基因之后發(fā)酵前期生長比較緩慢，利用的葡萄糖量減少，在發(fā)酵48 h時，乙醇產(chǎn)量只有7.3 g/L，在發(fā)酵84 h才達到最高乙醇產(chǎn)量 11.16 g/L，大約是對照菌株最高產(chǎn)量(19.69 g/L) 的一半；說明ptsG基因?qū)刂破咸烟寝D(zhuǎn)運有很大影響。

在LB+2.5% G+2.5% X培養(yǎng)基中，在發(fā)酵12 h時，缺陷菌株與對照組的乙醇產(chǎn)量分別為7.42 g/L和10.74 g/L，在發(fā)酵前24 h，缺陷菌株的乙醇產(chǎn)量沒有對照菌株的高，而在發(fā)酵 24 h之后，缺陷菌株的乙醇產(chǎn)量超過了對照組，由原來對照組的最高乙醇產(chǎn)量 13.13 g/L提高到了15.01 g/L，提高了14.32%；缺陷株SZ470乙醇轉(zhuǎn)化率為理論值的 89.13%。這可能是因為SZ470P能同時利用已糖 (葡萄糖) 和戊糖 (木糖)，從整體上提高了還原糖的消耗量，擴大了底物同時利用糖的范圍，提高了糖的轉(zhuǎn)化率，最終提高了乙醇的產(chǎn)量。

圖5 大腸桿菌ptsG缺陷株和對照菌株的乙醇產(chǎn)量Fig. 5 Ethanol yield of ptsG mutant strains and parent strains.

3 討論

利用基因打靶技術(shù)敲除生物代謝途徑中的關(guān)鍵基因，改變代謝流分布，構(gòu)建新的代謝途徑，在微生物代謝工程研究中具有重要作用。本文利用Red同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌的ptsG基因，在 LB+5% G培養(yǎng)基中，在發(fā)酵前 48 h，ptsG基因缺陷菌株的OD600值低于親株，生長比較緩慢[19]，是因為敲除了指導(dǎo)菌體將胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)的主要基因ptsG，使葡萄糖從胞外轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)的速度減慢所致?；蛉毕葜甑木芏仍诎l(fā)酵48 h之后，明顯比親株高，在進入對數(shù)生長期后獲得最大OD600值為 10.65，比對照組的最大菌密度高出11.2%。敲除后的SZ470P達到最大菌體密度的時間比對照菌株延后了，因為在大腸桿菌轉(zhuǎn)運葡萄糖的系統(tǒng)中，除了磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS) 之外，還有一些其他酶 (如酶ⅡGlc等)均可將葡萄糖轉(zhuǎn)運入微生物細胞內(nèi)[3]，因此，敲除基因ptsG后細胞可通過其他轉(zhuǎn)運酶的作用將胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運到胞內(nèi)，來攝取葡萄糖，在生長過程中攝取葡萄糖用于菌體的生長和繁殖，其最高OD600值是對照菌株的1.5倍。敲除了ptsG基因之后，大腸桿菌減少了對葡萄糖的攝取率，其葡萄糖的消耗量是對照菌株的50%，減弱了葡萄糖抑制效應(yīng)，使大腸桿菌葡萄糖代謝產(chǎn)物抑制現(xiàn)象得以解除，在六碳糖 (葡萄糖) 和五碳糖(木糖、阿拉伯糖等) 同時存在的情況下，缺陷株SZ470P能同時利用五碳糖和六碳糖，由于葡萄糖的抑制效應(yīng)得以解除，從而使木糖的消耗量由原來的 20%提高到 80%。在只有葡萄糖存在的培養(yǎng)基中，缺陷株乙醇產(chǎn)量是對照菌株的一半，這一方面是由于SZ470P菌株被敲除了轉(zhuǎn)運葡萄糖的ptsG基因，使消耗的葡萄糖減少；另一方面，攝取的葡萄糖更多的轉(zhuǎn)化為菌體的生物量。而在六碳糖 (葡萄糖) 和五碳糖 (木糖) 同時存在的情況下，混合糖能被同時利用，還原糖的消耗量提高，從而使其轉(zhuǎn)化成乙醇的量也相應(yīng)提高。

目前，在利用原料上，特別是以秸稈為廉價原料[1,20-23]，稀酸水解之后進行發(fā)酵[24]，其水解液中同時有五碳糖 (如木糖、阿拉伯糖等) 和六碳糖 (如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等)，如果利用酵母來進行發(fā)酵，則會造成大量五碳糖的浪費。利用代謝工程技術(shù)，構(gòu)建ptsG缺陷的大腸桿菌基因工程菌，可大大提高還原糖的利用，擴大同時利用底物的范圍，降低生產(chǎn)成本。由于高密度發(fā)酵過程的重要性[25]，大腸桿菌ptsG基因缺陷株的發(fā)酵特性及乙醇產(chǎn)量的提高還有待在發(fā)酵罐中進一步研究，在實現(xiàn)缺陷菌株高密度生長的同時，提高乙醇的產(chǎn)量。

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