沈伊娜，顧磊 ，張娟，陳堅(jiān)，堵國(guó)成

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

3 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris是一種廣泛應(yīng)用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，目前已經(jīng)有數(shù)百種外源蛋白及多肽在這個(gè)系統(tǒng)中得到了成功的表達(dá)，并進(jìn)行了工業(yè)化生產(chǎn)[1-2]。葡萄糖氧化酶(β-D-glucose ： oxygen 1-oxidoreductase ； EC 1.1.3.4，簡(jiǎn)稱 GOD) 是一種富含糖基的黃素蛋白，它通過(guò)利用分子氧作為電子受體專(zhuān)一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫[3]。GOD是生物領(lǐng)域中最主要的工具酶之一，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等行業(yè)中[3-4]。GOD大規(guī)模生產(chǎn)廣泛采用黑曲霉或青霉發(fā)酵，然而青霉和黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生許多雜蛋白不利于下游提取，產(chǎn)酶量低也成為生產(chǎn)瓶頸，為了解決這些問(wèn)題，近年來(lái)使用基因工程菌重組表達(dá)GOD受到研究人員的青睞[5-9]。周亞鳳等[9]利用P. pastorisGS115表達(dá)載體成功地構(gòu)建了 GOD高產(chǎn)甲基酵母工程菌株，GOD活力可達(dá)30～40 U/mL。Malherbe等[7]利用釀酒酵母為宿主，整合來(lái)自黑曲霉GOD基因，GOD最高產(chǎn)量為125 U/mL，是目前已報(bào)道的最高產(chǎn)量[3]，但是仍然存在表達(dá)效率不高、產(chǎn)量低、酶活低等問(wèn)題。

本研究室在前期的研究工作中，篩選了一株葡萄糖氧化酶高產(chǎn)菌株Aspergillus nigerBBE11721，擴(kuò)增出其編碼葡萄糖氧化酶的基因，并在P. pastorisGS115中成功表達(dá)。在此基礎(chǔ)上為了提高GOD的產(chǎn)量和降低生產(chǎn)成本，本文進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵條件。

P. pastoris在以甲醇作為唯一碳源和能源表達(dá)外源目的蛋白時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)爭(zhēng)奪碳源和能源，增加了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，并導(dǎo)致表達(dá)效率低下[10-11]。如何提高表達(dá)效率以及降低甲醇對(duì)細(xì)胞的毒害作用，以進(jìn)一步提高葡萄糖氧化酶的產(chǎn)量成為關(guān)鍵因素[12-13]。因此，本研究在詳盡分析生物量和甲醇濃度對(duì)重組P. pastoris高效表達(dá)影響的基礎(chǔ)上，通過(guò)甘油、山梨醇以及甘露醇和甲醇雙碳源混合流加策略，來(lái)降低甲醇的毒害作用提高菌體密度，提高胞內(nèi)啟動(dòng)子AOX1的表達(dá)效率和GOD生產(chǎn)強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)葡萄糖氧化酶的高效表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 菌株

以P. pastorisGS115為宿主，整合來(lái)自Aspergillus nigerBBE11721的葡萄糖氧化酶(GOD) 基因 (拷貝數(shù)為5個(gè))，同時(shí)具有His+和Mut+表型，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC No. M 2012266。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 YPD活化培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L。

1.2.2 分批發(fā)酵培養(yǎng)基(BSM)

85%磷酸 26.7 mL/L，CaSO4·H2O 0.93 g/L，K2SO418.2 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，KOH 4.13 g/L，甘油 40.0 g/L，PTM1 4.35 mL/L[14]。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 搖瓶培養(yǎng)

活化后，挑單菌落接種于 50 mL YPD中(50 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶)，并于 30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2 補(bǔ)料高密度發(fā)酵培養(yǎng)

將YPD中菌液按10%接種量接入3 L全自動(dòng)發(fā)酵罐 (LiFlus GM BioTRON，Korea) 中。以50%氨水和磷酸溶液控制pH 5.5，溫度30 ℃，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量維持溶氧30%以上。當(dāng)甘油耗盡 (DO迅速上升，且 DO＞60%時(shí))，開(kāi)始流加 50% (W/V)甘油 (含 12 mL/L PTM1)。當(dāng)菌體達(dá)到一定濃度后 (60 g/L、80 g/L或100 g/L左右)，停止補(bǔ)料。待甘油再次耗盡，繼續(xù)保持基質(zhì)匱乏狀態(tài)約 1 h且 DO＞60%后，開(kāi)始流加100%甲醇或者流加甘油、山梨醇、甘露醇和甲醇以不同質(zhì)量比混合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (含12 mL/L PTM1)，并且把誘導(dǎo)溫度降低至22 ℃誘導(dǎo)GOD表達(dá)。發(fā)酵過(guò)程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集[15]。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 菌體干重的測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液置于離心管中，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，將離心菌體置于105 ℃，烘至恒重，稱量并計(jì)算菌體干重 (DCW，dry cell weight，單位為 g/L)。

1.4.2 葡萄糖氧化酶活性的測(cè)定

方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[16]。酶活力單位定義：在30 ℃，pH 6.0 的條件下，1 min 從 1 μmol的 β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為1個(gè)葡萄糖氧化酶酶活力單位，以 U/mL表示。

1.4.3 甘油濃度的測(cè)定

方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

1.4.4 甲醇、山梨醇、甘露醇濃度的測(cè)定

甲醇?xì)埩魸舛炔捎昧骷訖z測(cè)儀測(cè)定與控制器 (FC2002，East China University of Science and Technology)。山梨醇、甘露醇采用高效液相色譜(HPLC) 法，應(yīng)用Agilent 1100高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。色譜柱為 Aminex HPX-87H(Bio-Rad)；流動(dòng)相：0.005 mol/L H2SO4；流速：0.6 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

1.4.5 醇氧化酶(AOX)活力測(cè)定

方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。酶活力單位 (1 U/g) 定義為：在一定菌體濃度下，37 ℃、pH 6.0的條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol的過(guò)氧化氫所需的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)前初始菌體濃度對(duì)GOD表達(dá)的影響

在大多數(shù)情況下，胞外重組蛋白的分泌同細(xì)胞濃度的增長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，所以高密度發(fā)酵是P. pastoris表達(dá)外源蛋白的普遍策略。

基于前期搖瓶?jī)?yōu)化結(jié)果，維持誘導(dǎo)階段的甲醇濃度為18 g/L，不同菌體濃度對(duì)GOD表達(dá)的影響如圖 1所示。當(dāng)誘導(dǎo)前初始菌體濃度為60.5 g/L時(shí)，誘導(dǎo)156 h GOD產(chǎn)量?jī)H為243.3 U/mL，干重為121 g/L。增加菌體濃度到101.6 g/L時(shí)，誘導(dǎo)156 h GOD產(chǎn)量達(dá)427.6 U/mL，比菌體濃度為60.5 g/L和83.8 g/L (310 U/mL) 時(shí)分別提高了75.8%和37.9%。在誘導(dǎo)初期，當(dāng)P. pastoris利用的碳源從甘油轉(zhuǎn)換到甲醇時(shí)，需要先由細(xì)胞合成一系列與甲醇代謝途徑相關(guān)的酶[19]，菌體濃度較大則含核糖體比較多，更有利于甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶的合成[20]，從而能快速代謝甲醇，誘導(dǎo)GOD更高效地表達(dá)。

2.2 甲醇濃度對(duì)GOD表達(dá)的影響

甲醇的濃度對(duì)P. pastoris異源蛋白的表達(dá)量有一定的影響，最適的甲醇濃度需要根據(jù)不同的異源蛋白進(jìn)行確定。

圖1 誘導(dǎo)初始菌體濃度對(duì)GOD表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of initial cell concentration on GOD production (A) and biomass (B) in the induction phase.

維持誘導(dǎo)前初始菌體濃度為100 g/L左右，不同甲醇濃度 (12、18和30 g/L) 對(duì)GOD表達(dá)的影響如圖2。當(dāng)甲醇濃度為18 g/L時(shí)，干重為179.2 g/L，GOD產(chǎn)量為427.6 U/mL，比甲醇濃度為 12 g/L (322.9 U/mL) 和 30 g/L (195.9 U/mL)，分別提高了 32.4%和 118.3%。體系中過(guò)高的甲醇濃度可能使細(xì)胞“中毒”，并裂解或死亡而釋放的胞內(nèi)蛋白酶[1]導(dǎo)致了重組蛋白 GOD降解；或者是由于過(guò)高的甲醇濃度抑制了甲醇代謝和其他代謝途徑關(guān)鍵酶的活性[21]，從而影響菌體產(chǎn)酶。甲醇濃度不足則可能難以啟動(dòng)AOX1基因，不能充分誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。因此，在一定的菌體濃度下，只有在合適的甲醇誘導(dǎo)強(qiáng)度下，才能使P. pastorisGS115高效表達(dá)GOD。

圖2 甲醇濃度對(duì)GOD表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of methanol concentration on GOD production (A) and biomass (B) in the induction phase.

2.3 誘導(dǎo)階段的雙碳源流加策略

2.3.1 甘油和甲醇的混合流加策略

甘油是P. pastoris最容易吸收利用的碳源，在誘導(dǎo)期加入少量甘油可以提高細(xì)胞活力，增加菌體密度和比生長(zhǎng)速率，從而提高單位體積外源蛋白的產(chǎn)量[22-24]。

維持誘導(dǎo)前初始菌體濃度為 100 g/L，甲醇?xì)埩魸舛?8 g/L，甲醇與甘油以不同的比例 (0、20∶1 (W/W)、20∶2 (W/W)、20∶4 (W/W)) 混合添加對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖3A所示。當(dāng)甲醇與甘油混合添加的比例為20∶2 (W/W) 時(shí)，效果最為明顯，GOD產(chǎn)量可達(dá)547.3 U/mL，比對(duì)照(427.6 U/mL) 提高了28.0%。而當(dāng)甲醇與甘油混合添加的比例為20∶4 (W/W) 時(shí)，體系中測(cè)出甘油存在少量累積，GOD的產(chǎn)量也和對(duì)照組相近。體系內(nèi)過(guò)量的甘油限制了AOX1啟動(dòng)子，從而影響外源基因的表達(dá)以及外源蛋白的比生產(chǎn)速率[25]。因此，甘油和甲醇以合適的比例混合添加雖然可以提高GOD產(chǎn)量，但對(duì)其殘留濃度控制要求較高，不利于大規(guī)模發(fā)酵。

2.3.2 山梨醇和甲醇的混合流加策略

與甘油不同，山梨醇是一種不會(huì)抑制AOX1啟動(dòng)子的碳源[23-25]，體系內(nèi)殘余的山梨醇不會(huì)對(duì)AOX1啟動(dòng)子產(chǎn)生抑制，而且山梨醇的存在可以有效減輕由于外源蛋白大量表達(dá)對(duì)細(xì)胞代謝造成的負(fù)擔(dān)，減少高濃度甲醇對(duì)細(xì)胞的毒害作用，并且增加碳源和能量供應(yīng)，提高菌體密度，從而提高外源蛋白表達(dá)量和比生產(chǎn)速率，并能降低產(chǎn)熱和耗氧速率，更有利于P. pastoris大規(guī)模高密度的發(fā)酵[26]。

本研究采用山梨醇和甲醇的雙碳源混合流加策略，即在誘導(dǎo)期采用甲醇和山梨醇混合添加(0、20∶1 (W/W)、20∶2 (W/W)、20∶4 (W/W))，誘導(dǎo)期 GOD的產(chǎn)量結(jié)果如圖 3B所示。當(dāng)甲醇和山梨醇混合比例為20∶2 (W/W)，發(fā)酵156 h，GOD的產(chǎn)量為 645.3 U/mL，比對(duì)照提高了50.9%。而當(dāng)甲醇和山梨醇混合比例為 20∶4(W/W) 時(shí)，GOD產(chǎn)量?jī)H為440 U/mL，可能當(dāng)山梨醇添加量較多時(shí)改變了發(fā)酵體系的滲透壓，也有可能雖然蛋白質(zhì)的合成率提高了，但此時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊能力會(huì)接近飽和，因此新合成的蛋白質(zhì)無(wú)法正確折疊，會(huì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累或者在胞內(nèi)被分解，加重了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)[27-28]，影響菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。由此可見(jiàn)，當(dāng)甲醇和山梨醇以合適的比例混合流加時(shí)，能顯著增加GOD的產(chǎn)量。

圖3 甘油、山梨醇與甲醇混合添加的發(fā)酵過(guò)程曲線Fig. 3 GOD production under the mixed carbon feeding strategy in the induction phase. (A) Glycerol co-feeding.(B) Sorbitol co-feeding.

2.3.3 甘露醇和甲醇的混合流加策略

甘露醇是山梨醇的同分異構(gòu)體，也是一種非抑制性碳源[26]，但是在P. pastorisMut+表型的報(bào)道很罕見(jiàn)。

本實(shí)驗(yàn)研究了甲醇和甘露醇 (0、40∶1(W/W)、20∶1 (W/W)、20∶2 (W/W)) 混合添加對(duì)P. pastorisGS115 Mut+產(chǎn)GOD的影響，誘導(dǎo)期的生物量、GOD產(chǎn)量結(jié)果如圖 4所示。當(dāng)甲醇與甘露醇混合添加比例為20∶1 (W/W)，誘導(dǎo)156 h時(shí)，GOD的產(chǎn)量和菌體密度為 711.3 U/mL和219.9 g/L，比甲醇單一流加策略下分別提高了66.3%和22.7%，同時(shí)比酶活為62 613 U/g，比對(duì)照 (54 845 U/g) 提高了14.2%。由此可見(jiàn)甘露醇和山梨醇一樣，不會(huì)影響菌體對(duì)甲醇的利用效果，同時(shí)也能提高菌體密度，顯著增加了 GOD的產(chǎn)量和增強(qiáng)了其生產(chǎn)強(qiáng)度。

2.3.4 雙碳源混合流加對(duì)GOD生產(chǎn)的綜合比較

表1比較了在誘導(dǎo)期3種不同的碳源和甲醇混合添加對(duì)發(fā)酵重要指標(biāo)的影響。在誘導(dǎo)期通過(guò)甘油、山梨醇以及甘露醇和甲醇的混合流加均增加了菌體密度、比生長(zhǎng)速率和 GOD比酶活，從而提高單位體積GOD產(chǎn)量。當(dāng)甲醇與甘露醇混合添加時(shí)GOD產(chǎn)量最高，達(dá)到711.3 U/mL，比添加山梨醇時(shí)提高了10.2%，比添加甘油時(shí)提高了30.0%，比對(duì)照提高了66.3%。甘露醇與甲醇的混合添加也顯著增強(qiáng)了 GOD的生產(chǎn)強(qiáng)度，誘導(dǎo)156 h生產(chǎn)強(qiáng)度為4.60 U/(mL·h)，是添加山梨醇的1.1倍，是添加甘油時(shí)的1.3倍，是對(duì)照的1.7倍。與單碳源和甘油相比，添加甘露醇和山梨醇的比產(chǎn)酶速率也有所提高。采用合適雙碳源混合流加策略可以提高菌體密度，增加單位體積外源蛋白的產(chǎn)量，使GOD的產(chǎn)量大幅度提高。同時(shí)甘露醇的添加量比山梨醇和甘油少，甲醇消耗減少的幅度也是比較大的，這非常有利于P. pastoris大規(guī)模發(fā)酵，在提高GOD產(chǎn)量同時(shí)也降低產(chǎn)熱及好氧速率[26]，降低生產(chǎn)成本。

圖4 甘露醇與甲醇混合添加的發(fā)酵過(guò)程曲線Fig. 4 Course of biomass (■), residual methanol concentration (○), GOD production (▲) and residual mannitol concentration (●) under the different mannitol co-feeding strategy in the induction phase. (A) Methanol: mannitol=0.(B) Methanol: mannitol=20:1.

表1 不同流加方式下細(xì)胞生長(zhǎng)和GOD合成過(guò)程參數(shù)比較Table 1 Comparison of parameters for GOD production under different mixed carbon sources during the induction phase

2.3.5 不同碳源對(duì)胞內(nèi)AOX酶的影響

Jungo等[27]提出 AOX醇氧化酶的合成受不同的碳源影響較大。P. pastoris的外源蛋白表達(dá)受AOX1啟動(dòng)子調(diào)控，AOX醇氧化酶是甲醇代謝途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶，它受甲醇的誘導(dǎo)啟動(dòng)，受碳源葡萄糖和甘油的阻遏[29]。然而山梨醇、甘露醇與甘油不同，它們是不會(huì)對(duì)胞內(nèi)啟動(dòng)子AOX1造成抑制的碳源，即發(fā)酵體系內(nèi)的山梨醇和甘露醇不會(huì)抑制AOX醇氧化酶的表達(dá)[23-25]。

通過(guò)測(cè)定AOX酶活性，結(jié)果如圖5所示。我們發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)前期，當(dāng)流加甘露醇 (20∶1(W/W)) 山梨醇 (20∶2 (W/W)) 以及甲醇單一流加策略下時(shí)，AOX酶活性均急劇增加，在60 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為8.8 U/g、8.2 U/g和5.2 U/g。由此可見(jiàn)，在誘導(dǎo)初期甘露醇、山梨醇等碳源以合適的比例與甲醇混合流加時(shí)，AOX醇氧化酶活性并沒(méi)有受到抑制，甚至分別比甲醇單一流加情況下提高了69.2%和57.7%，從這里初步推斷，在誘導(dǎo)前期甘露醇和山梨醇的存在可能在一定程度上減輕了由于大量表達(dá)外源蛋白對(duì)細(xì)胞代謝造成的負(fù)擔(dān)——降低產(chǎn)熱和好氧速率并且增加碳源和能量供應(yīng)[26]，從而提高了AOX1啟動(dòng)子的表達(dá)效率，加快了甲醇氧化途徑的代謝，進(jìn)而增加了GOD產(chǎn)量。而當(dāng)流加甘油 (20∶2，W/W)時(shí)，由于發(fā)酵體系中甘油的積累，在誘導(dǎo) 48 h之前AOX酶活性均受到抑制，表達(dá)效率不高。

在誘導(dǎo)中后期，不同混合碳源流加時(shí)的AOX酶活性差異不大，均先以相似的速度急劇下降，誘導(dǎo)96 h之后穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。初步推斷可能是因?yàn)榘l(fā)酵體系內(nèi)殘余甲醇濃度是一定的，但由于誘導(dǎo)表達(dá)中后期生物量的不斷快速增加而導(dǎo)致甲醇誘導(dǎo)不足，AOX1基因表達(dá)效率不高致使中后期AOX酶活性降低；也可能是因?yàn)榧状奸L(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用，同時(shí)抑制了甲醇代謝和其他代謝途徑關(guān)鍵酶的活性[30]，即細(xì)胞整體活力不足而導(dǎo)致對(duì)甲醇的代謝速率減慢，以致中后期AOX醇氧化酶活性降低。

圖5 混合碳源流加對(duì)胞內(nèi)醇氧化酶 (AOX) 的影響Fig. 5 Intracellular AOX activity under mixed carbon sources feeding strategies in the post-induction phase.

3 結(jié)論

甲醇誘導(dǎo)階段GOD酶活隨著誘導(dǎo)初始菌體濃度的增加而增加，并且在一定菌體濃度條件下，過(guò)高或者過(guò)低的甲醇濃度均不利于GOD生產(chǎn)。當(dāng)誘導(dǎo)階段初始菌體濃度為 100 g/L，維持體系中甲醇濃度 18 g/L，GOD產(chǎn)量最高為427.6 U/mL。

采用合適的雙碳源混合流加策略可以增加菌體密度，提高GOD的產(chǎn)量。尤其山梨醇和甘露醇是屬于對(duì)AOX1啟動(dòng)子的非抑制性碳源，能顯著增強(qiáng)醇氧化酶的活力，提高外源蛋白生產(chǎn)強(qiáng)度和表達(dá)效率，同時(shí)減少甲醇消耗。

其中，甘露醇與甲醇混合添加的效果最為顯著，GOD產(chǎn)量最高能達(dá)711.3 U/mL，是同類(lèi)文獻(xiàn)報(bào)道最高水平的6倍，實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的高效生產(chǎn)。

研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)由于3 L發(fā)酵罐的限制，對(duì)于誘導(dǎo)初始菌體濃度的增加有一定影響，在以后大規(guī)模發(fā)酵中可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以及如何提高中后期AOX醇氧化酶的活力和進(jìn)一步提高GOD的產(chǎn)量等是我們以后研究的方向。

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