魏梅梅，熊雅念，洪煬，黃莉妮，孟培培 ，艾德宙，張旻，傅志強，劉升發(fā) ，林矯矯

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點實驗室，上海 200241

2 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005

血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種慢性寄生蟲病，被世界衛(wèi)生組織認為是僅次于瘧疾的第2個最具社會經(jīng)濟破壞性的寄生蟲病，全球有數(shù)以百萬的人感染[1-2]。寄生于人體的血吸蟲主要有3種：日本血吸蟲、曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲，其中在我國流行的血吸蟲病是由日本血吸蟲(中國大陸株) 感染引起的，它嚴(yán)重影響著人類的健康，據(jù)統(tǒng)計我國 2 010年血吸蟲病人數(shù)達到325 824例[3]。在血吸蟲病治療方面，盡管有吡喹酮等有效的藥物，但由于較高的重復(fù)感染率及不斷使用這些抗血吸蟲藥物，可能導(dǎo)致抗藥蟲株的出現(xiàn)[4-6]?，F(xiàn)已有研究證實中國大陸株日本血吸蟲在吡喹酮藥物選擇壓力下可產(chǎn)生抗藥性[7]。有專家提出，對于預(yù)防措施，單獨使用疫苗或結(jié)合藥物治療可能是持續(xù)控制血吸蟲病較為理想有效的方法[8]。

Hawn等 1993年報道用放射性照射尾蚴免疫的鼠血清篩選曼氏血吸蟲cDNA文庫，得到一非 EF-hand家族蛋白SmIrV1的編碼基因[9]。Hooker等在1999年用去垢劑Triton X-14溶解的血吸蟲膜相關(guān)蛋白免疫家兔，制備多克隆抗血清，用該抗血清從日本血吸蟲 (菲律賓株) 表達cDNA文庫中篩到編碼SjIrV1的 cDNA序列基因。生物信息學(xué)分析表明SjIrV1蛋白與SmIrV1蛋白具有83%的相似性，一級結(jié)構(gòu)上保守的鈣結(jié)合位點及重組蛋白的鈣獨立性電泳試驗證明SjIrV1蛋白是一種功能性的鈣結(jié)合蛋白[10]。2011年本課題組張[11]在不同時期日本血吸蟲 (中國大陸株) 蟲體體被表膜蛋白質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上篩選到一個在血吸蟲童蟲和成蟲多個時期都有表達的膜蛋白66 kDa鈣結(jié)合蛋白SjCa66，經(jīng)生物信息學(xué)分析該基因與SjIrV1cDNA編碼序列一致，命名為SjIrV1。文中對SjIrV1進行了克隆和原核表達，對日本血吸蟲SjIrV1基因及其編碼蛋白的表達進行了分析，評估了SjIrV1重組蛋白在小鼠中誘導(dǎo)的免疫保護效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

日本血吸蟲中國大陸株尾蚴由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供；新西蘭大白兔(雄性，2.0～3.5 kg) 購自上海羅涇飛達實驗動物養(yǎng)殖場；6～8周齡雄性 (SPF級) BALB/c小鼠，購自斯萊克上海實驗動物中心。

1.1.2 cDNA文庫、質(zhì)粒與菌株

日本血吸蟲成蟲cDNA文庫，大腸桿菌菌株DH5α、BL21 (DE3)，原核表達載體質(zhì)粒pET28a (+) 均由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ，pMD19-T載體，T4 DNA連接酶，高保真LATaq酶，SYBR GreenⅡ購自 TaRaKa公司；Ni-NTA His-Bind Resin購自中科新生命生物科技有限公司；DNA Marker，Protein Marker，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG (羊抗鼠 IgG-HRP) 購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DAB顯色試劑盒、可溶性單組分TMB購于天根生物科技 (北京) 有限公司；硝酸纖維素膜 (Whatman) 購自經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司；Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L) 購于Invitrogen公司 (USA)；鼠抗6-組氨酸 (6-His)單抗、蛋白酶抑制劑購于Roche公司；山羊血清購自上海鼎國生物工程公司；DNA小量純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen生物技術(shù)有限公司；RIPA (強) 裂解液購于碧云天生物公司；Eppendorf Mastercycler ep梯度PCR儀，激光共聚焦掃描成像分析系統(tǒng)為 (型號CISi) 日本Nikon公司產(chǎn)品；蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置為美國 BIO-RAD公司產(chǎn)品；超聲波細胞破碎儀 (型號VCX-130) 為美國 SONICS公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀 (型號SynergyTM HT) 為美國BioTek公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集

新西蘭白兔分別以腹部貼片法感染20 000、8 000、5 000、2 000條尾蚴，感染7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA和蟲體蛋白的提取

取液氮中凍存7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d的日本血吸蟲蟲體，按Trizol試劑盒說明書分別進行總 RNA的提取。將各期別蟲體進行研磨，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，低溫超聲，離心，收集上清蟲體蛋白。

1.2.3 SjCa66 (SjIrV1) 基因的克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)本課題組在日本血吸蟲蟲體體被表膜蛋白的基礎(chǔ)上，選擇一個在多個時期都有表達的膜蛋白SjCa66 (AF030342.1)，以該蛋白編碼基因序列設(shè)計一對引物P1和P2 (表1)，以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板，PCR擴增含完整ORF的cDNA序列片段。PCR產(chǎn)物純化回收后，亞克隆至 pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細胞，挑選單個菌落擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pMD19-T-SjCa66，并送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將測序得到的 cDNA序列在 NCBI上進行同源性比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)；利用DNAStar軟件分析該基因的ORF，并對其氨基酸殘基數(shù)、組成、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量等進行分析；利用信號肽預(yù)測軟件 SignalP (www.cbs.dtu/services/Singnalp)進行信號肽分析。

1.2.4 SjIrV1在各期別蟲體的轉(zhuǎn)錄水平分析

分別提取 7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d蟲體和42 d雌、雄蟲體的總RNA，定量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以日本血吸蟲α-tubulin基因作為內(nèi)參，以獲得的各期別的日本血吸蟲 cDNA為模板，采用 SYBR Green法進行熒光定量 PCR(qPCR) 檢測SjIrV1基因在不同發(fā)育時期蟲體的表達量。分別設(shè)計α-tubulin和SjIrV1基因的實時定量 PCR引物 (表 1)，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，其工作濃度為10 pmol。反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaqII(2×) 10 μL，ROX Reference Dye II(50×) 0.4 μL，PCR Forward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.4 μL，DNA 模板 2.0 μL，加入 RNase free H2O 至總體積 20 μL；反應(yīng)條件為：50 ℃2 min，95 ℃ 30 s；然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；最后添加溶解曲線反應(yīng)95 ℃ 15 s，60 1 min ℃ ，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。每個反應(yīng)均做3個重復(fù)孔，7500 Software軟件進行計算分析，得出相對于每百萬α-tubulin基因的SjIrV1基因含量。

1.2.5 重組質(zhì)粒pET28a (+)-SjIrV1的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達、鑒定

將測序比對后的結(jié)果通過信號肽預(yù)測軟件SignalP分析，發(fā)現(xiàn)SjIrV1蛋白的第1～20個氨基酸為信號肽，根據(jù)SjIrV1基因的cDNA序列設(shè)計一對引物P3和P4 (表1)，以經(jīng)過測序驗證序列正確的pMD19-T-SjCa66質(zhì)粒為模板，于序列的5′端和3′端分別引入BamHⅠ、XhoⅠ兩個酶切位點，PCR擴增去除信號肽后的ORF序列片段。將 PCR擴增得到的產(chǎn)物酶切純化后亞克隆到原核表達載體 pET28a (+) 的多克隆位點上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET28a (+)-SjIrV1，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中。將陽性重組菌進行PCR鑒定，抽提其重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，并送至上海華津生物公司進行測序驗證。將重組菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達。反復(fù)凍融 3次，超聲破菌離心后，12%SDS-PAGE分析重組表達蛋白是以可溶性還是包涵體存在。可溶性rSjIrV1以Ni-NTA His-Bind Resin (Novagen公司) 純化，洗脫后的蛋白進行SDS-PAGE分析 (12%)，考馬斯亮藍R250染色，脫色后將表達的蛋白條帶切下，經(jīng)中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究分析中心對其進行膠內(nèi)酶解 (Trypsin，20 h)，抽提酶解肽段，毛細管高效液相色譜法 (RP-HPLC) 對酶解后的蛋白混合物進行分離，采用4 800串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀 (4 800 Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer)(Applied Biosystems，USA) 根據(jù)多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比進行全掃描，采集20個碎片圖譜，用BIOWORKS軟件搜索日本血吸蟲S. japonicum數(shù)據(jù)庫，確定所鑒定的目的蛋白的性質(zhì)。

1.2.6 Western blotting分析重組蛋白抗原性及各期別蟲體SjIrV1蛋白的表達

純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，低溫130 mA電轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素 (NC) 膜上，分別以免疫前鼠血清、重組蛋白免疫鼠血清、鼠抗 6-組氨酸 (6-His) 單抗以及感染日本血吸蟲鼠血清作一抗，以羊抗鼠 IgG-HRP作為二抗，二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 作為底物進行顯色。

將7 d、14 d、21 d、28 d、35 d蟲體蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到NC膜上，用tubulin單抗、SjIrV1重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清作一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，DAB作為底物進行顯色。

1.2.7 間接免疫熒光分析SjIrV1的蟲體組織定位

收集日本血吸蟲35 d成蟲蟲體，制成8 μm的冰凍切片，以rSjIrV1重組蛋白免疫的BALB/c小鼠血清作為一抗，Cy3標(biāo)記羊抗鼠 IgG (H+L)作為二抗，10 μg/mL DAPI溶液室溫避光復(fù)染，置熒光顯微鏡下觀察蛋白的分布情況。

1.2.8 rSjIrV1多克隆抗體的制備及rSjIrV1的動物免疫保護試驗

將 30只 6～8周齡 BALB/c小鼠隨機分成 3組，每組10只，分別為rSjIrV1重組蛋白免疫組、206佐劑對照組和PBS對照組。免疫組每只每次皮下注射含20 μg rSjIrV1蛋白和206佐劑的乳化液，每隔兩周免疫1次，共免疫3次，PBS對照組注射相同劑量的PBS，206佐劑對照組注射相同劑量的206佐劑和PBS混合液。于第1次免疫前1周及每次免疫后1周分別經(jīng)眼眶采集各組小鼠血液 0.1 mL，37 ℃靜置 1 h后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離并收集血清。末次免疫2周后，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚攻擊感染約 40條日本血吸蟲尾蚴。感染后第 42天眼球采血并處死各組小鼠，肝門靜脈灌注法收集蟲體并對其進行計數(shù)，計算減蟲率。同時采集肝臟，稱其重量，加入PBS緩沖液 (pH 7.2) 至終體積20 mL，組織勻漿器勻漿后，取1 mL勻漿液并加入1 mL 10%NaOH (W/V)，56 ℃水浴消化15 min，消化完全后混勻吸取20 μL樣品，顯微鏡下計算蟲卵數(shù)，每份樣本進行3次重復(fù)，取其平均值，按以下公式計算減蟲率和肝臟減卵率 (EPG為平均每克肝組織中所負荷蟲卵數(shù))：

減蟲率= (1?免疫組平均蟲荷數(shù)/206佐劑對照組平均蟲荷數(shù)) ×100%；

減卵率= (1?免疫組 EPG/206佐劑對照組EPG) ×100%。

1.2.9 間接ELISA法檢測特異性抗體

純化的 rSjIrV1重組蛋白用紫外分光光度計測定蛋白濃度，0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液(pH 9.6) 稀釋重組蛋白至終濃度為 10 μg/mL，以100 μL/孔4℃過夜包被96孔酶標(biāo)板，將收集的各組小鼠血清作為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG1-HRP和IgG2a-HRP作為二抗，可溶性單組分TMB避光顯色，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。BioTek公司酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗分析。

表1 PCR和qPCR引物Table 1 Primers used for PCR and qPCR

2 結(jié)果

2.1 SjIrV1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

在本課題組日本血吸蟲體被表膜蛋白質(zhì)組學(xué)分析中篩選得到的SjCa66基因，經(jīng)PCR克隆獲得含完整ORF大小為1 749 bp的cDNA片段。對該基因編碼的氨基酸序列分析表明，該基因編碼582個氨基酸，理論等電點為5.03，理論相對分子質(zhì)量為66 kDa。該蛋白N端第1～20個氨基酸為信號肽序列，第463～485個氨基酸之間為跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。去除信號肽后的理論相對分子量為63.80 kDa。BLAST分析表明該基因與編碼日本血吸蟲 (菲律賓株)SjIrV1序列完全一致，故命名為SjIrV1。

2.2 Real-time PCR分析各時期 SjIrV1轉(zhuǎn)錄表達水平

Real-time PCR分析結(jié)果表明，SjIrV1在日本血吸蟲各個蟲體發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄，其中 14 d蟲體和42 d雄蟲轉(zhuǎn)錄量較低，35 d和42 d蟲體表達量最高，42 d雌蟲的轉(zhuǎn)錄量顯著高于 42 d雄蟲，t檢驗分析結(jié)果表明42 d雌蟲與雄蟲轉(zhuǎn)錄量差異性極顯著，P＜0.001 (圖1)。

圖1 實時熒光定量PCR分析SjIrV1基因在日本血吸蟲不同階段蟲體的表達情況Fig. 1 Differential expression of SjIrV1 in different stages of S. japonicum analyzed by Real-time PCR. 7 d:7 days schistosomula; 14 d: 14 days schistosomula; 21 d:21 days schistosomula; 28 d: 28 days worms; 35 d:35 days worms; 42 d: 42 days worms; 42 d(f): 42 days female worms; 42 d(m): 42 days male worms.

2.3 重組質(zhì)粒 pET28a (+)-SjIrV1的誘導(dǎo)表達、重組蛋白純化及鑒定

經(jīng) PCR、雙酶切鑒定和測序，證明pET28a (+)-SjIrV1重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達的蛋白主要以可溶性形式存在，重組蛋白分子量約為94 kDa，比理論值67.80 kDa偏大 (SjIrV1去除信號肽后預(yù)測分子量約為 63.8 kDa，表達載體蛋白大小約4 kDa) (圖 2)。將該條帶切下送公司進行高效液相和質(zhì)譜鑒定，通過查詢血吸蟲S. japonicum數(shù)據(jù)庫，結(jié)果確定鑒定到登錄號為AAC62193.1的蛋白，分子量大小約為66 kDa，與本研究目的蛋白相符 (表2)。結(jié)果表明pET28a (+)-SjIrV1重組蛋白成功誘導(dǎo)表達并主要以可溶性形式存在，rSjIrV1得到較好的純化效果。

2.4 Western blotting檢測重組蛋白抗原性及各期別蟲體蛋白的表達

以純化重組蛋白作為抗原，重組蛋白免疫BALB/c小鼠血清、小鼠抗His-tag單抗以及感染日本血吸蟲42 d小鼠血清作為一抗進行Western blotting分析，結(jié)果顯示在94 kDa處有一明顯的識別條帶，而免疫前小鼠作為陰性對照在此處未有明顯條帶出現(xiàn)，表明重組蛋白具有良好的抗原性 (圖 3)。

圖2 SDS-PAGE分析pET28a (+)-SjIrV1/BL21重組蛋白的表達Fig. 2 SDS-PAGE ananlysis of the expression products of pET28a (+)-SjIrV1/BL21 in E. coli. M: low-molecular protein marker; 1, 2: supernatant and inclusion bodies of the recombinant protein, respectively. 3: purified recombinant protein of pET28a (+)-SjIrV1/BL21.

表2 rSjIrV1串聯(lián)質(zhì)譜 (BIOWORKS軟件) 結(jié)果分析Table 2 Database searching results of peptide mass of rSjIrV1

以各時期蟲體 (7 d、14 d、21 d、28 d、35 d)蛋白作為抗原，小鼠抗 tubulin mAb、SjIrV1重組蛋白免疫 BALB/c小鼠血清作為一抗除了在55 kDa處顯示出tubulin蛋白條帶外，在94 kDa和66 kDa處出現(xiàn)較明顯的兩條帶 (圖4)，HPLC和 MS/MS鑒定分析兩處均為 66 kDa鈣結(jié)合蛋白，即SjIrV1。

2.5 日本血吸蟲體內(nèi) SjIrV1蛋白的表達分布觀察

通過熒光顯微鏡可觀察到 Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗發(fā)出的紅色熒光，DAPI復(fù)染核后發(fā)出的藍色熒光(B)，以免疫前小鼠血清作陰性對照(A)，免疫熒光染色實驗結(jié)果表明，該蛋白廣泛分布于蟲體實質(zhì)及表膜，其中在表膜中表達最高 (圖5)。

圖3 pET28a (+)-SjIrV1重組蛋白的抗原性分析Fig. 3 Antigenicity analysis of recombinant protein pET28a (+)-SjIrV1. M: protein marker; 1: stained with infected mouse serum; 2: stained with mouse anti-His mAb; 3: stained with mouse serum against SjIrV1; 4:negative serum control.

2.6 免疫小鼠血清抗 rSjIrV1蛋白特異性抗體的檢測

利用間接 ELISA法檢測各組小鼠血清中抗rSjIrV1特異性 IgG抗體水平變化，實驗結(jié)果表明，重組蛋白免疫組小鼠在第1次免疫后就檢測到特異性抗 rSjIrV1重組蛋白的 IgG抗體，第 2次免疫后特異性IgG抗體滴度進一步升高，第3次免疫后和剖殺時變化不明顯。t檢驗分析表明，重組蛋白免疫組與PBS對照組和206佐劑對照組特異性 IgG抗體水平差異性極顯著 (P＜0.01)。206佐劑對照組和 PBS對照組在 3次免疫后抗rSjIrV1的特異性 IgG抗體滴度均未出現(xiàn)明顯的變化，只在剖殺時才出現(xiàn)低滴度的抗 rSjIrV1的特異性IgG抗體 (圖 6)。

圖4 各期別蟲體蛋白中SjIrV1的表達分析Fig. 4 Expression of SjIrV1 protein in different stages of S. japonicum analyzed by Western blotting. M:protein marker; 1?5: proteins of 7 days, 14 days, 21 days, 28 days, 35 days worms were probed with mouse serum against SjIrV1 and anti-tubulin mAb.

圖5 SjIrV1蛋白的免疫組織定位 (100×)Fig. 5 Immunolocalization of SjIrV1 in 35 d of S. japoicum(100×). secondary antibody Cy3-conjugated anti-mouse IgG (red) were used for fluorescence detection of SjIrV1 on worm section. DAPI (blue) was used to stain parasite nuclei. (A) The section was probed with native mice serum (the negative control). (B) The section was probed with anti-SjIrV1 mouse serum.

圖6 BALB/c小鼠血清抗rSjIrV1特異性IgG抗體水平檢測結(jié)果Fig. 6 Specific IgG level against SjIrV1 in the sera of BALB/c mice by ELISA. Mice were injected with rSjIrV1, 206 adjuvant and PBS. The asterisks (*) indicate significantly increased serum antibody titres compared with the PBS control (P<0.01).

用每次免疫后采集的血清作為一抗，對抗rSjIrV1蛋白特異性 IgG1和 IgG2a抗體進行測定，結(jié)果顯示，隨著3次免疫的進行，206佐劑組對照組IgG1和IgG2a抗體亞型沒有明顯的趨勢變化，但 rSjIrV1蛋白免疫組 IgG1和 IgG2a抗體亞型均呈上升趨勢且免疫組與對照組差異性均極顯著 (P＜0.01)，IgG1/IgG2a比值不斷下降，提示重組蛋白rSjIrV1可能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1型占主導(dǎo)的免疫反應(yīng) (表 3)。

2.7 動物保護性試驗結(jié)果

重組蛋白免疫保護試驗結(jié)果顯示與206佐劑對照組比較，rSjIrV1在 BALB/c小鼠中誘導(dǎo)了12.25%的減蟲率，34.07%的肝組織減卵率，t檢驗分析表明對照組與免疫組均沒有產(chǎn)生顯著性差異 (表 4)。

表3 rSjIrV1誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體亞型分析Table 3 IgG immune profile induced by vaccination with rSjIrV1

表4 BALB/c小鼠免疫保護試驗結(jié)果Table 4 Results of protective efficacy against S. japonicum challenge in mice induced by rSjIrV1

3 討論

Ca是真核生物體內(nèi)極其重要的第二信使，主要分布于細胞內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中，很多生理活動的調(diào)控都由鈣來完成，通過信號傳導(dǎo)通路，與血吸蟲尾蚴入侵宿主、細胞生長、鈣通路調(diào)節(jié)及蛋白磷酸化等生物進程密切相關(guān)[12]。組織中鈣離子的濃度必須在系統(tǒng)和細胞水平得到精細的調(diào)節(jié)，這項功能由種類繁多的鈣結(jié)合蛋白來完成[13]，成為血吸蟲寄生于宿主不可或缺的一類蛋白，是一類值得深入研究的疫苗候選分子或新藥物靶標(biāo)。所報道的血吸蟲鈣結(jié)合蛋白包括有EF-hand家族和非EF-hand家族蛋白，它們都具有鈣結(jié)合位點。EF-hand家族包括鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)、肌原蛋白 C及以微白蛋白為代表的可溶性的肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白。前兩者通過與Ca2+的結(jié)合，使蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，發(fā)揮其調(diào)節(jié)機能；后者通過結(jié)合游離鈣離子作為生理鈣或鈣庫源[14]。Hawn等用致弱尾蚴免疫鼠血清篩選曼氏血吸蟲cDNA文庫獲得SmIrV1和SmIrV5兩個基因，其中IrV5蛋白是WHO/TDR提出的血吸蟲疫苗候選分子[15]，SmIrV1和 SjIrV1均屬于非EF-hand結(jié)構(gòu)的鈣網(wǎng)織蛋白家族。

本研究將去除 N-末端區(qū)信號肽后的SjIrV1編碼基因亞克隆到帶有His-tag的pET28a (+) 原核表達載體中并在大腸桿菌中表達，經(jīng)SDS-PAGE分析表明獲得的重組蛋白分子量約為94 kDa，比理論值 (66 kDa) 偏大，把重組蛋白作抗原與抗 His-tag單抗作用，得到的陽性條帶分子量也為94 kDa，與純化的重組蛋白條帶分子量一致。進一步應(yīng)用高效液相法和MS/MS質(zhì)譜分析驗證該純化重組蛋白確定為目的蛋白SjIrV1，同時以抗rSjIrV1重組蛋白免疫鼠血清作為探針，Western blotting分析各期別蟲體蛋白表達情況時，顯示在66 kDa和94 kDa處出現(xiàn)明顯條帶，后經(jīng)HPLC和MS/MS進一步鑒定確認兩條帶中均含有目的蛋白 SjIrV1。Hooker等將SjIrV1亞克隆到 pQE30表達純化后 SDS-PAGE分析重組蛋白大小約90 kDa，與我們獲得的重組蛋白大小相近，都比理論值 (66 kDa) 偏大[10]。在 SDS-PAGE分析中會出現(xiàn)這種偏差，推測SjIrV1可能結(jié)合了某種物質(zhì)而改變了其構(gòu)象，使其顯示出相對分子質(zhì)量為94 kDa蛋白的情況，又或許是由于 SjIrV1的高酸性 (PI=5.03) 影響其與SDS的結(jié)合，根據(jù)已有研究報道鈣連蛋白、鈣網(wǎng)織蛋白、鈣鎂蛋白、SmIrV1[16-9]均出現(xiàn)相對于理論蛋白大小在 SDS-PAGE分析中遷移率變慢的情況，這些蛋白與 SjIrV1一樣都呈現(xiàn)高酸性，而OvRAL1酸性相比于上述蛋白低，該蛋白純化后的蛋白條帶與預(yù)測的蛋白大小最接近[19]。還有一種說法是由于 His-tag中的堿性氨基酸與目的蛋白中的氨基酸共同作用，影響了蛋白與SDS的結(jié)合而造成目的蛋白在 SDS-PAGE中遷移變慢導(dǎo)致偏差[20]。就目前的研究進展來看，出現(xiàn)這種蛋白大小比理論值偏差較大的具體原因尚未能明確，待進一步的深入研究。

Real-time PCR分析基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示隨著蟲體的生長發(fā)育及成熟，SjIrV1呈上調(diào)趨勢。日本血吸蟲尾蚴在侵入宿主后第15～16天兩性童蟲開始配對，出現(xiàn)合抱，第24天雌蟲開始產(chǎn)卵[21]，根據(jù)實驗結(jié)果在第35天和42天蟲體中SjIrV1轉(zhuǎn)錄水平顯著升高并且差異性顯著，42 d雌蟲的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于雄蟲，推測可能與日本血吸蟲在蟲卵細胞的快速合成過程中對 IrV1需求的增加有關(guān)。有報道稱鈣結(jié)合蛋白和鈣釋放蛋白在體內(nèi)的有規(guī)律變化可能在卵母細胞成熟、受精及早期胚胎發(fā)育的過程中對調(diào)控 Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡中起著重要的作用[22]，文中動物免疫試驗中用重組rSjIrV1免疫小鼠，誘導(dǎo)了34.07%的減卵率，但是相比于減蟲效果，產(chǎn)生了更高的減卵效果，推測 SjIrV1作為鈣結(jié)合蛋白可能在血吸蟲雌蟲產(chǎn)卵和蟲卵形成中發(fā)揮一定的作用。免疫熒光結(jié)果顯示 SjIrV1在蟲體中廣泛分布且在體被表膜大量表達，已有研究表明該蛋白與 Calnexin，Calreticulin在氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上相似，其中與 Calnexin更為接近[10]，表明 SjIrV1和Calnexin在功能上有很大的相似性，而Calnexin是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種重要的類凝集素分子伴侶，參與細胞內(nèi)的許多重要生物功能，如輔助新合成肽鏈的折疊和裝配、轉(zhuǎn)運，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)量控制系統(tǒng)[23]，因此 SjIrV1在血吸蟲的這些生物進程中是否發(fā)揮著一定作用有待進一步實驗驗證。

盡管吡喹酮作為治療血吸蟲病非常有效，但不能阻止重復(fù)感染或?qū)ΜF(xiàn)有的損傷起修復(fù)作用[24]，同時目前對血吸蟲的疫苗候選抗原的研究也有了重大進展，但已研制的血吸蟲疫苗分子絕大多數(shù)只能提供部分的保護力。因此尋找新的有效的候選疫苗抗原或通過優(yōu)化組合合成新抗原分子，以提高免疫保護作用是當(dāng)前疫苗研究的一個重點。鈣結(jié)合蛋白作為血吸蟲寄生于宿主不可或缺的蛋白，SjIrV1又是一種功能性的鈣結(jié)合蛋白，間接ELISA和Western blotting結(jié)果均顯示重組抗原 rSjIrV1可被血吸蟲感染小鼠血清識別，表明日本血吸蟲 SjIrV1具有較好的免疫原性，該蛋白有可能成為日本血吸蟲疫苗的候選抗原和藥物靶點。用純化的 rSjIrV1蛋白免疫小鼠后，實驗結(jié)果顯示小鼠產(chǎn)生了較高水平的特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體，抗 rSjIrV1抗體亞型IgG1/IgG2a比值不斷下降，IgG2a主要激活Th1型輔助細胞，而IgG1主要促進Th0前體細胞向Th2細胞轉(zhuǎn)化[25]。推測 rSjIrV1可能誘發(fā)小鼠抗日本血吸蟲感染的Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)，但以Th1型占主導(dǎo)。保護性動物實驗顯示，重組蛋白 rSjIrV1免疫的 BALB/c小鼠，其減蟲率和減卵率分別為 12.25%和 34.07%，rSjIrV1誘導(dǎo)宿主雖然未能產(chǎn)生很好的保護效果，但可以通過其他途徑來進一步提高 rSjIrV1的免疫保護效果。已有研究報道可通過更換佐劑來改變免疫反應(yīng)的極化方向[26]，例如，SjGP-3結(jié)合ISA 70 MVG佐劑時主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型免疫反應(yīng)，而與另外3種佐劑聯(lián)合使用時主要誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1/Th2混合型免疫反應(yīng)[27]。還可以將來自于多種抗原的保護性抗原表位制成嵌合蛋白，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的保護效果[27]。也可以考慮針對不同發(fā)育階段、不同部位和不同抗原成分選擇2種或2種以上的多種疫苗候選分子的聯(lián)合應(yīng)用，以達到協(xié)同和增強作用[28]。

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