王曉旭,夏鴻飛,李 慧,姜長陽
(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116081)
平車前(Plantago depressa)又名大葉車前、車輪菜、牛舌草等,為車前科車前屬多年生草本植物。平車前為臨床上的常用中藥,全草和種子均可入藥[1]。平車前有清熱、利尿、明目、祛痰等功效,用于治療小便黃少、暑濕泄瀉、尿路感染、目赤澀痛、痰多咳嗽等疾?。?-3]?,F(xiàn)代研究證實(shí),平車前除具有以上功效外,還具有止瀉護(hù)肝、降壓、抑菌、降低血清膽固醇等多種藥理作用[4]。在臨床上平車前主要用于治療水腫、慢性活動(dòng)性肝炎、隱匿性腎炎[5]、陰道炎等癥。此外,平車前還可作為野菜食用和畜禽的青飼料。車前屬植物多數(shù)分布于受人為干擾強(qiáng)烈的生境中,是理論生態(tài)學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)研究的理想材料[6]。研究者的調(diào)查發(fā)現(xiàn),由于平車前具有重要的藥用、食用和飼用價(jià)值,多年來的大量采挖和生存環(huán)境的破壞,導(dǎo)致近年來野生平車前資源的分布和數(shù)量都急劇減少,現(xiàn)在,在大連郊區(qū)已經(jīng)很難采到野生平車前。因此,尋求平車前快速繁殖的方法顯得尤為重要。此前已有許多關(guān)于車前植物的研究報(bào)道[7-12],多集中于其藥用價(jià)值及成分分析方面,迄今未見平車前無性系建立的報(bào)道。本次試驗(yàn)針對(duì)平車前愈傷組織增殖和分化進(jìn)行研究,篩選出適合平車前無性系建立的最佳條件,進(jìn)而建立平車前的無性系,有利于平車前的大量繁殖,獲得好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及生態(tài)意義。
將采自大連郊區(qū)山坡上的平車前植株用清水沖洗干凈后,根和葉柄剪成5 cm左右的段狀,葉片剪成若干5 cm左右的小塊狀后,放到磨口廣口瓶中,用自來水振蕩洗滌10 min,之后用體積分?jǐn)?shù)為0.05%安利洗滌液洗滌約10 min,再用自來水振蕩洗滌3~5次至材料無泡沫。將材料置于超凈工作臺(tái)上,用體積分?jǐn)?shù)為70%~75%的乙醇滅菌12s左右后,迅速用無菌水振蕩洗滌3~5次,再加入濃度為0.05%的HgCl2溶液浸泡滅菌14 min,緊接著用無菌水洗滌4~5次即獲得無菌材料。MS培養(yǎng)基中蔗糖含量為30 g·L-1,1/2MS 培養(yǎng)基中蔗糖含量為 15 g·L-1,瓊脂含量為 4.5 g·L-1,pH 5.8 ~6.0,每日持續(xù)光照12 h,光照強(qiáng)度為2 000Lx,培養(yǎng)溫度為24℃。
1.2.1 不同生長素對(duì)根、葉片和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響
將無菌材料中的根和葉柄剪成長0.5 cm左右的小段,葉片剪成邊長為0.5 cm左右的小塊。剪取材料時(shí),盡可能取幼嫩部位。將以上3種材料分別接種于添加不同生長素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng),材料先置于暗箱中培養(yǎng)15 d,再置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。每種培養(yǎng)基每種材料接種培養(yǎng)30個(gè)。
1.2.2 不同濃度配比的6-BA和2,4-D對(duì)平車前葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響
將無菌的平車前葉柄剪成0.5 cm左右的小段,接種到附加不同濃度6-BA和2,4-D的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng),每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)40個(gè)材料,先置于暗箱中培養(yǎng)15 d,再置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d。試驗(yàn)重復(fù)3次。觀察平車前葉柄的出愈情況,45 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
1.2.3 不同濃度6-BA、2,4-D 和 NAA 配比對(duì)愈傷組織增殖的影響
將在 MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)的愈傷組織分成0.4~0.5 cm左右的塊狀后,接種在附加不同濃度6-BA、2,4-D和NAA配比的增殖培養(yǎng)基上,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行平車前愈傷組織的增殖培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種50個(gè)材料,每種處理重復(fù)3次。觀察愈傷組織的生長情況,45 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的增殖狀況。
1.2.4 不同濃度6-BA、KT和NAA對(duì)愈傷組織分化的影響
以MS為基本培養(yǎng)基、附加不同濃度的6-BA、KT和NAA,設(shè)計(jì)出12種培養(yǎng)基,將 MS+6-BA0.2 mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖30 g/L這一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后顏色嫩綠的愈傷組織接種到各種培養(yǎng)基中,每種培養(yǎng)基接種100個(gè)直徑約為0.5cm的愈傷組織團(tuán)塊,置于恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期45 d的愈傷組織分化培養(yǎng)并統(tǒng)計(jì)分化率,此試驗(yàn)重復(fù)2次。把分化培養(yǎng)的平車前不定芽從基部剪下,接種到與顆粒狀愈傷組織分化培養(yǎng)相同的培養(yǎng)基上,進(jìn)行不定芽的分化繼代培養(yǎng)。
1.2.5 不同生長素對(duì)平車前不定芽生根的影響
將上述繼代分化培養(yǎng)的不定芽從基部剪下,接種到以1/2MS為基本培養(yǎng)基,分別附加 IAA 0.2 mg/L、IBA 0.2 mg/L、NAA 0.2 mg/L、2,4 - D 0.2 mg/L 和蔗糖 15 g/L 的培養(yǎng)基上。接種時(shí)不定芽植物學(xué)下部的生長點(diǎn)插入培養(yǎng)基,于變溫光照條件下進(jìn)行生根培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)45個(gè)材料,試驗(yàn)重復(fù)2次。
1.2.6 煉苗移栽
將培養(yǎng)著生長旺盛,根系發(fā)達(dá)試管苗的培養(yǎng)瓶打開瓶塞,將試管苗轉(zhuǎn)移到有水的燒杯中,置于陽光不能直射的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,煉苗3d后移栽到上半層分別為干凈河沙、爐灰渣和園土,下半層為肥沃園土的溫室花盆中,移栽試驗(yàn)重復(fù)2次,共移栽300株。
外植體接種10 d后,葉片邊緣及葉柄、根兩端切口出現(xiàn)膨大,已形成白色的愈傷組織;暗箱中培養(yǎng)15 d后,轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),在以2,4-D為生長素的培養(yǎng)基上愈傷組織顏色慢慢轉(zhuǎn)為嫩黃色(見圖1)。45 d后統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表1。由表可見以葉柄為外植體愈傷組織誘導(dǎo)率優(yōu)于葉片和根,葉片的誘導(dǎo)率要高于根。單獨(dú)使用2,4-D的誘導(dǎo)效果最好,NAA次之,單獨(dú)使用IBA和IAA兩種生長素幾乎不能誘導(dǎo)這三種平車前材料形成愈傷組織。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長,含有NAA的培養(yǎng)基愈傷組織會(huì)分化成根。試驗(yàn)結(jié)果表明,葉柄是平車前愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體,2,4-D是平車前愈傷組織誘導(dǎo)的最佳生長素。
圖1 誘導(dǎo)的平車前愈傷組織Fig.1 The induction of callus
表1 不同生長素對(duì)不同材料愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 The effects of different auxin on callus induction of different explants
由表2可見,接種培養(yǎng)的平車前葉柄在所有培養(yǎng)基中都能誘導(dǎo)形成愈傷組織,每種培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率都達(dá)到了100%。但從愈傷組織的生長速度和愈傷組織的長勢(shì)看,4號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成的愈傷組織生長速度快、長勢(shì)好。接種在這種培養(yǎng)基上的葉柄,培養(yǎng)10d左右外植體兩端切口開始出現(xiàn)愈傷組織,隨后愈傷組織開始迅速生長。初期形成的愈傷組織外表光滑、淺黃色的半透明狀,培養(yǎng)到45d變成直徑為0.2cm左右黃綠色顆粒狀。觀察還表明,當(dāng)2,4-D濃度過高時(shí),抑制愈傷組織生長。6、7號(hào)培養(yǎng)基出現(xiàn)水浸狀愈傷組織,可能與其生長素濃度較高有關(guān)。因此,MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L 是愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。注:+++為長勢(shì)好,++為長勢(shì)較好,+為長勢(shì)一般。
表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對(duì)葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.2 The effects of different hormone combinations on callus induction of stripes
接種10 d后可見愈傷組織開始慢慢增大。由表3可看出,試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基均能夠不同程度的使愈傷組織增殖。觀察結(jié)果表明,雖然2,4-D是誘導(dǎo)平車前愈傷組織的最佳生長素,但卻不適合愈傷組織繼代培養(yǎng)。在3號(hào)培養(yǎng)基即附加了濃度為0.2 mg/L 6-BA和濃度為2.0 mg/L NAA、基本培養(yǎng)基為MS的培養(yǎng)基上,愈傷組織的增殖速度最快,所培養(yǎng)出的顆粒狀愈傷組織質(zhì)地疏松,并呈有光澤的嫩綠色(見圖2),生長速度較快,試驗(yàn)證明此種愈傷組織具有分化能力。把在3號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)45d的愈傷組織,在相同培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)3代,所形成的愈傷組織的外觀仍然保持不變。以上試驗(yàn)表明,MS+6-BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L是平車前愈傷組織增殖的理想培養(yǎng)基。
圖2 愈傷組織的增殖培養(yǎng)Fig.2 The proliferation of callus
表3 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對(duì)愈傷組織增殖的影響Tab.3 The effects of different hormone combination on callus proliferation
由表4可以看出,在不加激素、只單加6-BA、KT兩種細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中平車前顆粒狀愈傷組織均不能分化,而在不同濃度配比的6-BA和NAA,KT和NAA的培養(yǎng)基中,平車前的顆粒狀愈傷組織會(huì)不同程度地分化出根(見圖3)。由此也可以看出,平車前愈傷組織可能含有較多的內(nèi)源生長素。但添加三種激素的培養(yǎng)基中,愈傷組織分化出了不定芽。在添加6-BA 1.0 mg/L、KT1.0 mg/L和NAA0.5 mg/L的培養(yǎng)基上,分化培養(yǎng)到14d左右時(shí),愈傷組織顆粒即可分化出可見芽點(diǎn)。分化培養(yǎng)到45d時(shí),不僅顆粒狀愈傷組織的分化率達(dá)到了87%,每個(gè)愈傷組織顆粒還會(huì)分化形成為有3~7個(gè)不定芽組成的長勢(shì)較好叢生不定芽。但在光照不強(qiáng)的情況下,愈傷組織會(huì)因?yàn)榛ㄇ嗨剌^多而變成紫紅色(見圖4)。把上述分化培養(yǎng)形成的叢生不定芽從基部剪下,接種到相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的分化培養(yǎng)。經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)證明,不定芽經(jīng)過45d培養(yǎng),平均每個(gè)培養(yǎng)的不定芽可分化生長出高5 cm以上的不定芽5.7個(gè)。以上試驗(yàn)表明,MS+6 - BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L是愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基。
圖3 分化出根的愈傷組織Fig.3 Differentiation out of the root of callus
圖4 分化后出現(xiàn)花青素的愈傷組織Fig.4 Anthocyanins in callus
表4 不同濃度6-BA、KT和NAA對(duì)愈傷組織分化的影響Tab.4 The effects of different hormone combination on callus differentiation
28 d觀察統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表5。在添加IAA培養(yǎng)基上生根率為100%且試管苗長勢(shì)最好。觀察發(fā)現(xiàn),在添加IAA培養(yǎng)基上,不定芽培養(yǎng)至第8 d開始生根,從平均生根數(shù)、根長以及苗長勢(shì)等方面看,變溫條件下有利于平車前生長芽生根的生長素依次為IAA、NAA、IBA和2,4- D。因此,IAA是平車前生長芽生根的最佳生長素。
表5 生長芽變溫光照下生根情況Tab.5 The rooting situation of Plantago depressa with poikilothermal illumination
移栽后30 d統(tǒng)計(jì)證明:移栽的理想基質(zhì)為園土,移栽成活300株,成活率為100%。
定植后30 d統(tǒng)計(jì)證明:定植成活 100株,成活率100%。定植成活的試管苗生長良好,當(dāng)年開花結(jié)果,保持了野生平車前的植物學(xué)性狀(見圖5)。
圖5 移栽的試管苗Fig.5 Tube seedlings of transplanting
對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo),取材部位[13],生理狀態(tài)及外植體大小都會(huì)影響培養(yǎng)結(jié)果。在植物的組織培養(yǎng)中用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體一般取自幼嫩部位或新生長的器官組織,如幼嫩的葉片、根、花、莖段、塊根和塊莖等。本次研究發(fā)現(xiàn),葉柄是平車前愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體,根和葉片不適合愈傷組織誘導(dǎo)。將培養(yǎng)材料置于暗培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)7d后取出進(jìn)行光照培養(yǎng),這樣操作更有利于愈傷組織的誘導(dǎo)[14]。平車前愈傷組織的誘導(dǎo)也需要進(jìn)行暗培養(yǎng),直接進(jìn)行光照培養(yǎng)會(huì)引起外植體的死亡。誘導(dǎo)愈傷組織,2,4-D的生長調(diào)節(jié)活性最強(qiáng),NAA次之,IAA和IBA的作用較弱較差[15]。本次研究證明,平車前愈傷組織的誘導(dǎo)的最佳生長素是 2,4 -D。MS+6-BA0.2 mg/L+2,4-D2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平車前葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基,MS+6 -BA0.2 mg/L+NAA2.0 mg/L+蔗糖30 g/L是平車前愈傷組織繼代增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基。在愈傷組織分化培養(yǎng)的過程中,最好是先誘導(dǎo)分化出芽,因?yàn)樾纬裳亢笤谄浠亢苋菀仔纬筛?。但愈傷組織先分化形成根則會(huì)抑制芽的形成[16]。生長素/細(xì)胞分裂素比例決定著芽和根的分化。一般來說,當(dāng)生長素比細(xì)胞分裂素比值高時(shí),有利于根的生長,比值低時(shí)有利于芽的生長,中間比值利于愈傷組織的誘導(dǎo)和分化[17-18]。本次研究發(fā)現(xiàn),在不同濃度配比的6-BA和NAA,KT和NAA的培養(yǎng)基中,平車前的顆粒狀愈傷組織會(huì)不同程度地分化出根。只有在添加6-BA、NAA和KT三種激素的培養(yǎng)基中,平車前愈傷組織分化出了不定芽,分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+KT1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+蔗糖30 g/L。分化培養(yǎng)的愈傷組織需要充足的光照,在試驗(yàn)過程中,由于光照不足有的愈傷組織會(huì)因?yàn)榧?xì)胞含有較多的花青素而呈現(xiàn)紫紅色。
[1]鄭太坤.中國車前草的形態(tài)鑒定[J].中國中藥,1990,15(7):6-7.
[2]劉力豐.車前草研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥指南,2009,3(5):40-41.
[3]鄒立峰,韓志和,劉振亞,等.車前子栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè),2000,(4):6.
[4]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部)[K].北京:人民衛(wèi)生出版社,1990:49.
[5]章平富,高素珍.單味車前草治療隱匿性腎炎[J].浙江中醫(yī),2000,35(8):355.
[6]李平,陳華,李銀心.大車前體外再生體系的建立和優(yōu)化[J].生物工程學(xué)報(bào),2005,(6):64 -70.
[7]涂藝聲.車前的離體培養(yǎng)和植株再生[J].江西科學(xué),1995,13(3):149-152.
[8]劉艷輝,趙映.車前草中黃酮類化合物的提取及其含量的測(cè)定[J].湖南理工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,(6):63 -64.
[9]季大洪.中藥車前研究與應(yīng)用概況[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志,2001,19(6):361-362.
[10]董杰明,袁昌魯.車前草及芒苞車前草化學(xué)成分及其形態(tài)學(xué)研究[J].遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2002,4(3):229 -230.
[11]吳斐華,王奇志,梁敬鈺,等.車前化學(xué)成分和保肝活性[J].中國天然藥物,2006,4(6):435 -439.
[12]回瑞華,侯冬巖,李鐵純,等.中國車前草揮發(fā)性化學(xué)成分分析[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2004,23(8):85 -87.
[13]許雪梅,劉寶光,陳程.外植體取材部位和遺傳基礎(chǔ)對(duì)紅皮云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11(6):32-33.
[14]趙國凡,羅鋼.菊花愈傷組織誘導(dǎo)及器官再生[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào),1991,18(3):31 -35.
[15]周維燕.植物細(xì)胞工程原理與技術(shù)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2001:62.
[16]涂藝聲.經(jīng)濟(jì)植物大規(guī)??焖俜敝臣夹g(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009:15.
[17]胡孔峰,胡如善,張慎舉.植物組織培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用[M].河南:科學(xué)技術(shù)出版社,2006:23.
[18]BRUKHIN VB,BATYGINA TB.Embryo culture and somatic embryogennesisi in culture Of Paeonia anomala[J].Phytomorpholopy,1994,44(3/4):15 - 157.