黨阿麗，陳立娟，王玉文，張恩波，杜世彧

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150001)

在金針菇深層發(fā)酵過程中，應(yīng)對其發(fā)酵液進(jìn)行糖量檢查，以便有針對性地進(jìn)行管理和控制。糖量化學(xué)分析測定方法有很多，如碘量法、3，5－二硝基水楊酸比色法、蒽酮比色法、斐林氏法等。其中，斐林氏法是生產(chǎn)實踐中常用的快速定糖方法。為此，筆者根據(jù)自己的試驗條件進(jìn)行如下的糖量測定。

1 材料、儀器和試劑

(1)材料

測定樣液:我們從20株中篩選出的一個適于液體培養(yǎng)的金針菇菌株之深層發(fā)酵液。

(2)儀器

適宜的吸管、容量瓶、燒杯、三角燒瓶、滴定管等玻璃儀器;電爐、天平、離心機等。

(3)試劑

硫酸銅、次甲基藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、醋酸鉛、硫酸鈉等。

2 步驟和方法

2.1 試劑溶液的配制［1，2］

(1)斐林試劑:甲液，稱取15g硫酸銅(CuSO4·5H2O)和0.05g次甲基藍(lán)，用蒸餾水定容至1L。乙液，稱取50g酒石酸鉀鈉、54g氫氧化鈉和4g亞鐵氰化鉀，用蒸餾水定容至1L。

(2)0.1%標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液:準(zhǔn)確稱取干燥恒重的葡萄糖1.00g，先用少量蒸餾水使之溶解，加8mL濃鹽酸以防微生物生長，再用蒸餾水定容至1L。

(3)10%醋酸鉛溶液:稱取10g醋酸鉛溶于100mL蒸餾水中即可。

(4)6N鹽酸:以等體積的蒸餾水稀釋試劑鹽酸。

(5)6N氫氧化鈉溶液:250g氫氧化鈉溶于1L蒸餾水中即可。

2.2 還原糖的測定

(1)樣品處理

除蛋白:將適量的金針菇發(fā)酵液于2 500rpm離心10min，取其上清液25mL，加入2.5mL10%醋酸鉛溶液，用蒸餾水定容至50mL，混勻。然后1 000rpm離心5min。

除剩余Pb2+:取上述除蛋白之上清液10mL于一小三角瓶內(nèi)，加入0.5g硫酸鈉，振搖，離心之。棄去沉淀，再用蒸餾水使其上清液補足10mL，待測定。

(2)樣品測定

取經(jīng)處理的樣液及其它試劑按表1加入三角瓶中。

表1 樣液和試劑加法及加量Tab.1 Reagents addition and addition dosage of the sample solution

按斐林氏熱滴定裝置測定［1］。

(3)計算

發(fā)酵液中還原糖含量的計算公式為:

Ve是樣液3次平行測定所耗用糖液總毫升數(shù)的平均值。

在該測定中，上式可簡化為:

2.3 總糖的測定

(1)樣品處理

量取15mL混勻的發(fā)酵液于一小玻璃容器中，加入適量的6N鹽酸，水浴加熱30min，再用6N氫氧化鈉中和酸，用蒸餾水稀釋至60mL，離心之。取其上清液25mL，加入12.5mL10%醋酸鉛溶液，其余操作與還原糖的測定相同。

(2)樣品測定

與還原糖的測定相同。

(3)計算

在該測定中發(fā)酵液中總糖含量的計算公式為:

3 結(jié)果和討論

3.1 試驗測定結(jié)果見表2［3］

3.2 討論

(1)本方法的關(guān)鍵是在保證試驗操作各項條件一致性情況下的快速滴定，即在沸騰狀態(tài)下3min之內(nèi)將不到2.00mL的剩余糖液以4～5秒一滴的速度滴至終點。為此，應(yīng)根據(jù)預(yù)測定試驗在未滴定之前預(yù)先加入V體積糖液。否則，滴定速度過慢，一方面會使反應(yīng)液蒸發(fā)過多而改變?nèi)芤簼舛鹊葪l件;另一方面，在接近滴定終點時，由于還原型的次甲基藍(lán)遇到空氣后又能轉(zhuǎn)為氧化型的次甲基藍(lán)而導(dǎo)致滴定終點判斷的錯誤，影響試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 金針菇菌絲體發(fā)酵液分析測定結(jié)果Tab.2 Analysis results of Flammulina velutipes in fermented mycelium liquid

(2)滴定終點的判斷:肉眼觀察到藍(lán)色消失而出現(xiàn)黃色時即為滴定終點。

(3)通過對還原糖測定數(shù)據(jù)的分析，可知只要嚴(yán)格操作(包括各試劑的準(zhǔn)確量取及其條件的一致)該法就有較高的精密度，這說明該法有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。但若要提高總糖測定的準(zhǔn)確性，我們認(rèn)為取樣是很重要的，必須從混合均勻的發(fā)酵液中取出具有代表性的樣液進(jìn)行測定，結(jié)果才有意義。

(4)在測定之前，必須對樣品進(jìn)行處理，因為如果不除去發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，則在沸騰時會產(chǎn)生泡沫而帶起部分反應(yīng)液，這樣在一定程度上就會影響反應(yīng)正常進(jìn)行。剩余鉛離子的存在也會影響滴定終點的判斷，從而導(dǎo)致錯誤結(jié)果。

(5)按上述公式計算所得的糖含量實際上指的是發(fā)酵液經(jīng)離心除去其中的沉積物后之上清液的糖含量，如果說這可達(dá)到測定目的及滿足要求，則可將其視為發(fā)酵液的糖含量。但上清液的糖含量與發(fā)酵液的糖含量在數(shù)值和含意上是不同的，所以，從嚴(yán)格意義上講，計算發(fā)酵液中糖的百分含量時應(yīng)將式中吸取測定樣品毫升數(shù)折算成相應(yīng)的發(fā)酵液體積(毫升數(shù))即可。

［1］朱儉.生物化學(xué)實驗［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1981:4－8.

［2］洪震，卯曉嵐.食用藥用菌實驗技術(shù)及發(fā)酵生產(chǎn)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1992:233－236.

［3］杜世彧，黨阿麗，王鳳云.金針菇菌絲體的深層培養(yǎng)及多糖制?。跩］.生物技術(shù)，1996，6(6):41 －44.