朱良玉，周麗萍，張 玉，熊 燕，冷海楠

(黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040)

眾所周知，我們生活的環(huán)境充滿各種輻射，輻射傷害會引發(fā)各種健康問題。輻射產(chǎn)生的自由基對人類危害較大的主要是羥自由基(·OH)和超氧自由基(O2·)。人體皮膚受輻射傷害的主要機理是羥自由基和超氧自由基使皮膚細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中磷脂鏈發(fā)生鉸鏈，造成細胞膜空洞，引發(fā)細胞內(nèi)一系列負(fù)面的生化反應(yīng)，最后導(dǎo)致細胞失活、凋亡。多酚化合物是分子中具有多個羥基酚類植物成分的總稱，當(dāng)今研究證明多酚能對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護作用，通過清除自由基，防止輻射誘發(fā)的質(zhì)膜破壞和DNA斷裂，協(xié)助肌體保護膠原蛋白，起到抗氧化、抗衰老、抗輻射的效用，同時還具有增白、保濕、改善皮膚彈性等作用［1－6］。

本試驗應(yīng)用超聲波萃取法，提取東北地產(chǎn)小蘋果和東北優(yōu)勢分布的松科類植物中的多酚成分，通過提純、上柱、濃縮、有效成分和清除能力的測試、復(fù)合制劑配比、檢測等試驗，試制多酚噴霧制劑，以期為防輻射產(chǎn)品的研制提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

沒食子酸、蘆丁、濃硫酸、無水乙醇、無水三氯化鋁、鎢酸鈉、溴水、濃鹽酸、硫酸鋰、無水碳酸鈉、30%過氧化氫、s－5樹脂。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波破碎儀KQ－5200，北京益植康生物科技有限公司;

紫外可見分光光度計T6，北京普析通用公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R－205B，上海申勝儀器公司;

電熱恒溫水浴鍋NDJ－1，北京醫(yī)療電子儀器廠;

高速萬能粉碎機FJ－200，天津泰斯特儀器公司;

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG－9240;上海一恒科技有限公司;

電子天平，上海精天電子儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 超聲波萃取

正常室溫環(huán)境，將當(dāng)?shù)禺a(chǎn)小蘋果準(zhǔn)確稱量100g打碎成汁液用70%乙醇1 000mL浸提;溫度50℃，超聲波萃取20min，棉質(zhì)紗布4層過濾后抽濾得到澄清液，采用Folin－酚法測吸光度計算多酚含量，紅松測法同上。通過計算得出蘋果多酚含量0.16mg/g，紅松多酚含量0.15mg/g。將4 500mL和3 500mL蘋果和紅松過濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到60mL蘋果液剩余和50mL紅松液剩余，用s－5樹脂上柱，再用蒸餾水200mL，80%乙醇300mL洗脫后繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸出乙醇，得到蘋果濃縮液75mL，紅松濃縮液75mL。用蒸餾水稀釋不同濃度測定多酚含量、羥自由基和超氧自由基清除率。

1.3.2 多酚清除羥自由基能力測定

通過殘留的羥自由基與水楊酸之間的相互作用來測定蘋果多酚對羥自由基的清除作用。體系中通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH氧化水楊酸產(chǎn)生對510 nm光有特征吸收的2，3－二羥基苯甲酸，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物確定·OH的清除率。清除率(%)=［1－(A1－A2)/A0］×100%。

1.3.3 多酚清除超氧陰離子能力測定

采用鄰苯三酚的自氧化作用建立超氧陰離子體系。采用抗壞血酸作為本試驗的陽性對照品，用以評價受試物的抗氧化能力。多酚及抗壞血酸對超氧陰離子的抑制率通過公式清除率(%)=［1－(A1－A2)/A0］×100%計算。

2 結(jié)果與分析

通過表1的數(shù)據(jù)可以看出稀釋液中蘋果多酚含量1.38 mg/mL羥自由基清除率最大，稀釋液中蘋果多酚含量0.91 mg/mL時超氧自由基清除率最大。羥自由基和超氧自由基清除率的總體趨勢是隨著多酚含量的增加而上升，達到最高值時回落(圖1)。稀釋液中多酚含量在2.75mg/mL到0.91mg/mL時清除率較高，但由于噴霧制劑不宜有顏色，因此選擇0.91mg/mL濃度的稀釋液進行配比，既降低了成本，顏色澄清適宜又保持了對自由基的清除率較高。

表2，稀釋液中松多酚含量2.95mg/mL時羥自由基清除率最大，松多酚含量0.91mg/mL時超氧自由基清除率最大。羥自由基和超氧自由基清除率的總體趨勢是隨著松多酚含量的增加而上升即松多酚含量越高清除羥自由基和超氧自由基能力越強，清除能力與松多酚含量呈正相關(guān)線性關(guān)系(圖2)。但稀釋液松多酚含量在1.48mg/mL以上時，液體顏色較深呈草綠色，不適宜做噴霧制劑，因此綜合來看宜選擇在0.98mg/mL濃度的紅松稀釋液，顏色澄清無色，綜合的清除能力較好，且相對成本較低。

表1 不同含量的蘋果多酚羥基和超氧自由基清除率Tab.1 Rate of cavenging hydroxyl and superoxide radicals of apple polyphenol

圖1 蘋果多酚對羥自由基和超氧自由基清除能力趨勢圖Fig.1 Scavenging superoxide and hydroxyl radical abilityof apple polyphenol

表2 不同含量的松多酚對羥基和超氧自由基的清除率Tab.2 Rate of cavenging hydroxyl and superoxide radicals of pine polyphenols

綜上所述蘋果稀釋液多酚含量選擇0.91mg/mL、紅松稀釋液多酚含量0.98mg/mL，按照一定比例進行配比，復(fù)合型制劑羥自由基和超氧自由基的清除能力如下:

復(fù)合液配比試驗中，配方1和9中紅松或蘋果單方樣在復(fù)合液中比例最大，從表4的數(shù)據(jù)和圖3、4中可以看出，復(fù)合液中單方樣比例占主導(dǎo)地位時，清除自由基能力反而較低，當(dāng)兩個單方以試驗設(shè)定的濃度以5∶5配比時，清除羥自由基能力較高，如配方5;當(dāng)配比為6∶4時，清除超氧自由基能力較高，如配方6，這初步說明復(fù)合制劑按照配方5和6進行配比，可以產(chǎn)生協(xié)同或加合作用，其他比例配比產(chǎn)生不同程度的拮抗作用。

圖2 不同含量的松多酚對羥自由基和超氧自由基的清除率Fig.2 Scavenging superoxide and hydroxyl radical abilityof pine polyphenol

表3 稀釋500倍后按照比例配比羥自由基和超氧自由基的清除率Tab.3 Rate of scavenging hydroxyl and superoxide radicals of pine polyphenol:apple polyphenol with 500 times dilution

圖3 復(fù)合配比液(蘋果∶紅松)對羥自由基清除率Fig.3 Rate of cavenging hydroxyl free radical of apple/Korean pine

根據(jù)表1、2可知松多酚制取液清除能力高于蘋果多酚，在復(fù)合制劑配比試驗中，從配方1和9中，依然證實了松多酚制取液清除能力高于蘋果多酚。

相比單方制劑，復(fù)合制劑的清除自由基能力明顯降低，這有可能是由于成分中有效集團互相遮蔽，或是相互反應(yīng)形成新物質(zhì)從而降低了清除率，應(yīng)從兩種提取液中有效成分的結(jié)構(gòu)、化學(xué)反應(yīng)構(gòu)型等方面進一步深入研究。

圖4 復(fù)合配比液(蘋果∶紅松)對超氧自由基清除率Fig.4 Rate of scavenging superoxide radical of apple/Korean pine

3 結(jié)論與討論

本項試驗研究驗證了蘋果和紅松中提取的植物多酚類物質(zhì)具有較好的清除自由基能力。多酚含量1.38mg/mL的蘋果稀釋液清除羥自由基能力可達64.17%，多酚含量0.91mg/mL其超氧自由基清除率為23.74%。多酚含量2.95mg/mL的松針稀釋液羥自由基清除率為81.92%，最大超氧自由基清除率為16.13%。在本項目的試驗方法下紅松提取液清除羥自由基能力明顯高于蘋果提取液。

經(jīng)綜合數(shù)據(jù)分析蘋果多酚和松多酚復(fù)合制劑采用蘋果多酚含量0.91mg/mL和松多酚含量0.98mg/mL的稀釋液進行配比，比例為5∶5時，二者出現(xiàn)協(xié)同或加合作用，其他配比顯示出不同程度的拮抗作用。

復(fù)合液清除自由基能力明顯比單方制劑清除自由基能力降低，分析這種結(jié)果原因:操作的誤差;兩種多酚成分發(fā)生功能團相互遮蔽，或產(chǎn)生新的物質(zhì)。有待在多酚化學(xué)結(jié)構(gòu)、成分分析等方面深入研究。

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