郭立姝，于麗萍，殷 博，曹亞彬，吳皓瓊，牛彥波，甄 濤，黨阿麗

(黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010)

基于硫桿菌能夠氧化硫生成硫酸的特性，其在工業(yè)生產(chǎn)中已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用，如濕法冶金、重金屬回收、煤炭脫硫［1－6］等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，也有一些研究報(bào)道［7］，使用硫粉和一些富含磷鉀的礦石粉與有機(jī)物料一起進(jìn)行堆肥，利用自然存在的硫桿菌的作用，顯著降低了堆肥物料的pH值，提高了堆肥中的有效磷、有效鉀的含量，提高了堆肥的質(zhì)量。張靜、楊清等［8］研究了硫桿菌在不同類型鹽堿土壤中的應(yīng)用，研究結(jié)果表明了其對降低土壤pH有明顯作用，處理的幾種土壤其pH有不同程度的降低。趙曉進(jìn)、李亞芳等［9］使用硫磺粉進(jìn)行改良鹽堿地的研究也是基于硫桿菌的作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，使用硫粉處理種植棉花的土壤，降低了土壤的pH，改善了土壤的養(yǎng)分狀況，促進(jìn)了棉花植株的生長。吳曦、陳明昌等［10］使用硫磺處理種植油菜的堿性土壤，顯著降低土壤的pH值，增加土壤有效磷含量。與對照相比，施硫磺后土壤pH值最大降幅為0.5個單位;當(dāng)硫磺用量為120 mg/kg時(shí)土壤有效磷含量最高，比對照增加了68.6%。同時(shí)施用硫磺能增加油菜植株生物量，降低油菜植株體內(nèi)硝酸鹽含量，提高硝酸還原酶的活性和植株吸磷量，與對照相比，油菜植株生物量最大增加了29.64%，植株體內(nèi)硝酸鹽含量降低了58.6%，硝酸還原酶活性提高了近1.8倍，吸磷量增加了1.55倍。這些研究結(jié)果證明了硫桿菌在改良堿性土壤方面的應(yīng)用效果和潛力，為此，筆者在前期研究的基礎(chǔ)上［11］，針對自行分離選育的氧化硫硫桿菌TT03進(jìn)行轉(zhuǎn)化單質(zhì)硫的研究，為實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料:嗜酸性氧化硫硫桿菌TT03(Acidithiobacillus thiooxidans)為研制單位自行分離鑒定。堿斑土壤取自肇東市西4公里的公路收費(fèi)站附近;堿性耕作土壤取自肇東市宋站鎮(zhèn)附近農(nóng)田。

表1 TT03對堿斑土壤影響的試驗(yàn)方案Tab.1 The test scheme on effect of TT03 on highly alkaline soil

1.1.2 培養(yǎng)基:史塔克培養(yǎng)基［13］組成:2g(NH4)2SO4、3gKH2PO4、0.01gFeSO4·7H2O、0.5gMgSO4·7H2O、0.25 gCaCl2、10gS、水 1 000mL、pH4.0;制備:除硫粉外，其他成分溶解水中，在0.8kgf/cm2下滅菌30min;硫磺粉隔水常壓滅菌，使用前加入培養(yǎng)基中。固體史塔克培養(yǎng)基補(bǔ)加20g水洗瓊脂，以10gNa2S2O3替代硫磺粉，過濾方式除菌，使用前加入培養(yǎng)基中。

表2 TT03對堿性耕作土壤影響的試驗(yàn)方案Tab.2 The test scheme on effects of TT03 on alkaline soil

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備:在史塔克液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的TT03菌液，在低溫高速離心機(jī)中離心，收集菌體，再以無菌生理鹽水洗滌1～2次至pH到中性為止，再用無菌生理鹽水稀釋至原體積，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氧化硫硫桿菌TT03對堿斑土壤作用的試驗(yàn)方法:土壤風(fēng)干細(xì)化后與硫粉混合均勻，再加入菌液及水，使土壤潮濕而不滲水為止，待處理的土樣分別裝入小花盆中，每盆500g。至培養(yǎng)室中培養(yǎng)，白天升溫至25℃以上，夜間自然溫度，過程中定期補(bǔ)充水以保持土壤濕潤。具體的處理方法見表1。

圖1 TT03及硫粉處理堿斑土壤的pH變化過程Fig.1 The change of pH in alkaline soil after processed by TT03 and the sulfur

1.2.3 氧化硫硫桿菌TT03對堿性耕作土壤作用的試驗(yàn)方法:稱取5kg的堿性耕作土壤，其原始pH為8.27，加入單質(zhì)硫粉0.5g，液體菌劑15mL，混合均勻后，平鋪到帶孔塑料板上，土層厚度為30cm，均勻噴水，在保濕培養(yǎng)箱放置，室溫在28℃，處理期間視水分情況補(bǔ)充水分，以保證土壤的潮濕狀態(tài)(水分控制在15% ～25%)。在此條件下處理，定期取樣測定。試驗(yàn)以不加菌劑為對照處理。

1.2.4 采用酸堿滴定法測定酸度，以硫酸含量表示;采用沉淀法測定硫酸根含量;采用堿解擴(kuò)散法測定堿解氮;采用碳酸氫鈉法測定速效磷;采用醋酸銨浸提法測定速效鉀;pH采用電位儀法測定;重碳酸鹽采用雙指示劑滴定法測定［12－13］。固氮作用強(qiáng)度、硝化作用強(qiáng)度、氨化作用強(qiáng)度、磷轉(zhuǎn)化強(qiáng)度、酚降解強(qiáng)度、土壤呼吸強(qiáng)度的測定參考“土壤酶及其研究法”［14］進(jìn)行。

1.2.5 計(jì)算方法:液體中單質(zhì)硫粉的轉(zhuǎn)化率以實(shí)際培養(yǎng)TT03后產(chǎn)生的硫酸量與加入單質(zhì)硫粉按理論被完全轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的硫酸量的百分比表示。土壤中單質(zhì)硫粉的轉(zhuǎn)化率以實(shí)際培養(yǎng)TT03后產(chǎn)生的硫酸根含量與加入單質(zhì)硫粉按理論被完全轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的硫酸根的百分比表示。

表3 TT03與硫粉處理后堿斑土壤的主要成分含量變化 mg/gTab.3 The change of primary nutrient in highly alkaline soil after processed by sulfur and TT03

2 結(jié)果

2.1 TT03及硫粉對堿斑土壤的作用

利用TT03及硫粉處理堿斑土壤過程中，空白處理(對照2)與菌懸液處理(對照1)的pH變化不明顯，代表了土壤的自然狀態(tài)。外源的菌懸液與硫粉進(jìn)入土壤后，土壤的性狀發(fā)生改變。隨菌懸液與硫粉用量的提高，pH的下降幅度與速度皆有顯著的提高(圖1)，以處理3的效果最為明顯，處理結(jié)束時(shí)pH由初始的10.03下降到8.78，pH下降幅度為1.25。除了pH的變化以外，堿斑土壤的內(nèi)部性狀也發(fā)生改變，重碳酸鹽有較大幅度的下降，硫酸根含量猛增，速效磷含量顯著增加(表3)。綜合表中的結(jié)果，可以判定硫酸根上升、重碳酸鹽下降與速效磷增加三者之間是緊密相關(guān)的。TT03及硫粉處理堿斑土壤也引起土壤微生物活動的變化(表4)，除固氮強(qiáng)度沒有明顯的變化以外，其他的生化指標(biāo)皆向著有利于農(nóng)作物生長的方向改變，體現(xiàn)出了TT03及硫粉處理堿斑土壤的效果。

表4 TT03與硫粉處理后堿斑土壤的生化指標(biāo)變化Tab.4 The change of biochemical function in highly alkaline soil after processed by sulfur and TT03

2.2 TT03對堿性耕作土壤的作用

以堿性耕作土壤、硫粉、TT03菌液及水組成基本培養(yǎng)物料(表2)，在相同的條件下培養(yǎng)，其試驗(yàn)的結(jié)果列于圖2中。在試驗(yàn)期內(nèi)，對照1的硫酸根含量微有上升，基本與未處理前相同;對照2的硫酸根含量逐漸而緩慢的升高，培養(yǎng)到第63d時(shí)pH下降到8.11，硫酸根含量由原始樣品的18.2mg/kg上升到64.6mg/kg，提高了3.55 倍，表明即使在堿性土壤中，仍然有土著的硫桿菌存在;處理樣品的硫酸根含量在7d后開始迅猛增長，28d時(shí)pH為7.94，硫酸根含量達(dá)到187.4mg/kg，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率達(dá)56.4%，隨后增長趨于緩慢，在培養(yǎng)至63d時(shí)，pH為7.73，硫酸根含量上升到232.3mg/kg，是初始含量的12.76倍，單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率達(dá)71.4%。在同等條件下，添加TT03菌劑處理相比于不添加TT03菌劑的對照2，在培養(yǎng)到63d時(shí)，轉(zhuǎn)化單質(zhì)硫生成硫酸根的量提高了3.59倍，試驗(yàn)結(jié)果表明外源添加氧化硫硫桿菌對堿性土壤中單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化有顯著促進(jìn)作用。

圖2 TT03在堿性土壤中對硫的轉(zhuǎn)化Fig.2 The sulfur changed by TT03 in alkaline soil

堿性土壤中外源加入TT03菌劑與硫粉，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)處理，生成的硫酸改變了土壤的性狀(表5)。

表5 TT03與硫粉處理后堿性土壤營養(yǎng)成分的變化Tab.5 The change of primary nutrient in alkaline soil after processed by sulfur and TT03

首先土壤的pH明顯下降，經(jīng)過28d與63d的處理，pH分別下降到7.94與7.73;同時(shí)由于土壤pH下降，使得土壤中營養(yǎng)物質(zhì)被更有效地溶出，土壤的速效養(yǎng)分明顯提高，水解性氮由培養(yǎng)前的20.13 mg/kg分別提高到21.22 mg/kg與 22.65 mg/kg，分別增加到原值的 105.36% 與112.51%;速效磷由培養(yǎng)前的12.11 mg/kg分別提高到18.18 mg/kg、32.45 mg/kg，分 別 增 加 到 原 值 的 為150.12%、178.49%;速效鉀由培養(yǎng)前的 79.6mg/kg 分別提高到132.45 mg/kg、178.24 mg/kg，分別增加到原值的166.39%、223.91%;相比較而言，有效磷、有效鉀的增幅效果遠(yuǎn)高于水解氮，這是由于土壤中氮磷鉀的存在形式不同及硫酸對它們的溶出效果不同而造成的結(jié)果。由于單質(zhì)硫被氧化成硫酸，土壤中硫酸根的含量大幅度上升，與完全空白對照與單施硫粉對照相比，處理28d時(shí)硫酸根含量分別提高4.5倍與9.9倍，處理63d時(shí)，硫酸根含量分別提高3.6倍與10.4倍;同時(shí)由于酸堿中和作用，土壤中的部分重碳酸鹽被轉(zhuǎn)化為二氧化碳而排放，其含量下降，在培養(yǎng)到28d與63d時(shí)，由初始的766.5 mg/kg分別下降到650.4 mg/kg與605.3 mg/kg(表6)。

表6 TT03與硫粉處理后堿性耕作土壤pH與硫酸根的變化Tab.6 The change of pH and sulfate ions in alkaline soil after processed by sulfur and TT03

3 討論

氧化硫硫桿菌TT03對硫的氧化取于其生存的環(huán)境與硫的供給，在其能耐受的pH環(huán)境下，對硫的氧化能夠持續(xù)進(jìn)行。在堿性土壤中，環(huán)境土壤呈堿性，TT03仍能生長，可能是由于堿性土壤的總體環(huán)境與微環(huán)境之間的差異造成，在微觀環(huán)境下，某些土壤顆粒的環(huán)境條件及外源加入的硫粉顆粒會滿足TT03的生長要求，并且隨TT03生長產(chǎn)酸，微觀環(huán)境的改變會進(jìn)一步有利于其生長。TT03對土壤速效營養(yǎng)的影響是明顯的，速效磷、速效鉀的大幅度提高是土壤向酸性變化的具體體現(xiàn)，酸性條件更有利于一些難溶性磷或鉀化合物的溶解。研究對TT03用于堿性土壤改良僅進(jìn)行了初步的探索，結(jié)果表明了TT03在此方面的效果與潛力，更多的問題將在今后的工作中深入研究。

［1］楊顯萬，邱定蕃.濕法冶金［M］.北京:冶金工業(yè)出版社，1997.

［2］吳為榮，鄭志宏.氧化硫硫桿菌的耐氟馴化試驗(yàn)研究［J］.有色金屬(冶煉部分)，2007，(3):38－40.

［3］孫艷，吳鋒.硫桿菌浸出廢舊MH/Ni電池中重金屬研究［J］.生態(tài)環(huán)境，2007，16(6):1674 －1678.

［4］黃峰源，王世梅.氧化硫硫桿菌TS6的生長條件及其對重金屬耐受性［J］.研究環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，26(8):1290 －1294.

［5］張悅秋，謝廣元.氧化硫硫桿菌氮代謝及其對煤炭脫硫影響的研究［J］.潔凈煤技術(shù)，2007，13(4):32－34.

［6］何鋒，周立祥，王電站.利用嗜酸性硫桿菌的生物產(chǎn)酸作用處理洗毛廢水［J］.環(huán)境科學(xué)，2007，28(2):382 －386.

［7］鄭士民.自養(yǎng)微生物［M］.北京:科學(xué)出版社，1983.

［8］張靜，王清.利用硫氧化細(xì)菌改良鹽堿土［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(地球科學(xué)版)，2009，39(1):147 －151.

［9］趙曉進(jìn)，李亞芳.硫磺改良鹽漬土效果初探［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2008，26(4):74 －78.

［10］吳曦，陳明昌.堿性土壤施硫磺對油菜生長、土壤pH和有效磷含量的影響［J］.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2007，13(4):671－677.

［11］郭立姝，殷博，曹亞彬，吳皓瓊.用于鹽堿土壤處理的氧化硫硫桿菌的選育及鑒定［J］.生物技術(shù)，2010，20(6):61 －63.

［12］張行峰.實(shí)用農(nóng)化分析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［13］鮑士旦.土壤農(nóng)化分析［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

［14］關(guān)松蔭.土壤酶及其研究法［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1986.