李思明，沙長(zhǎng)青，楊 非

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所應(yīng)用醫(yī)學(xué)微生物室，哈爾濱 150010;2.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150001;3.哈爾濱市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150087)

真菌是醫(yī)院內(nèi)感染常見(jiàn)微生物，由真菌引起的感染臨床診斷率較低、病情進(jìn)展迅速且變化快，因此死亡率高，其中念珠菌感染病死率高達(dá)55%～70%。真菌感染按感染部位可主要分為表淺真菌感染和深部真菌感染兩大類。表淺部真菌只侵犯表淺角化組織(如皮膚，毛發(fā)、指甲等)，引起身體如頭、手足、體、股等癬癥，發(fā)病率高。深部真菌感染主要侵犯內(nèi)臟、骨骼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并以白色念珠菌的繼發(fā)感染比較多見(jiàn)，致死率高，危害性較大［1-2］。現(xiàn)市面上所售藥物大多為西藥，如兩性霉素B、萘替芬、氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬等，這些藥物對(duì)于淺表部真菌感染難以完全治愈，容易復(fù)發(fā)，具有一定的毒副作用。而且近年來(lái)由于廣譜抗生素大量使用，以及一些免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用使耐藥株增多，真菌感染病日趨嚴(yán)重，因此尋找廣譜、高效、毒副作用小的抗真菌新藥具有十分重要的意義［3-4］。

中藥是中華民族的瑰寶，我國(guó)勞動(dòng)人民幾千年智慧的結(jié)晶。中藥復(fù)方包括古代流傳下來(lái)的有確切療效的傳統(tǒng)方劑，也包括現(xiàn)代臨床使用的療效明確的一些新復(fù)方。幾千年來(lái)所積累的方劑數(shù)量多達(dá)數(shù)十萬(wàn)，明代的《普濟(jì)方》所收載的方劑達(dá)61 739首，近年來(lái)我國(guó)科研人員對(duì)流傳下來(lái)的方劑更是費(fèi)盡心血整理研究，僅1997年出版的《中醫(yī)方劑大辭典》中選收的方劑就達(dá)96 592首。各少數(shù)民族也積累了大量的藥方，常見(jiàn)的如藏藥有400多種，蒙藥500多種，維藥310種，壯藥70多種，彝藥324種，白藥151種，苗藥163種，等等。中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)資源，其價(jià)格低廉、效果確實(shí)。因此，尋找能夠治療淺表皮真菌感染的中藥并對(duì)其進(jìn)行深入研究，尋找其活性部位或者單體，探明其物質(zhì)基礎(chǔ)，提高藥物療效有著十分重要的意義和廣闊的市場(chǎng)前景。近年來(lái)，中藥現(xiàn)代化的研究遇到了一些難題和理論上的瓶頸，中藥往往由很多味中藥組成，包含的化學(xué)成分有成千上萬(wàn)，有些復(fù)方往往由很多種化學(xué)成分共同作用，因此，中藥作用的化學(xué)成分和作用機(jī)理很難闡述清楚，對(duì)藥物的質(zhì)量控制也造成了一定困難。而在國(guó)際上，上市藥物必須確定作用成分和作用機(jī)理，這就對(duì)中藥進(jìn)一步研究、走向世界造成了很大的困難。一部分科研工作者試圖完全用西醫(yī)的理論體系來(lái)研究并尋找中藥中起作用的化學(xué)單體，但往往發(fā)現(xiàn)中藥化學(xué)成分是一個(gè)整體作用，在經(jīng)過(guò)成分拆分后往往分開幾部分都沒(méi)有作用，這就要求我們要以創(chuàng)新的方法進(jìn)行研究，盡快攻克中藥現(xiàn)代化中存在的難題［5-6］。

珊瑚蘚凈是一種治療足癬的民間藥，經(jīng)臨床證明對(duì)足癬有很好的療效，目前還沒(méi)有對(duì)其有效成分和藥理學(xué)的相關(guān)研究。足癬病多由淺部或者深部真菌感染而生。引起足癬的真菌很多，主要有白色念珠菌、紅色毛蘚菌、須子樣毛蘚菌(石膏樣毛癬菌)等［7-9］。本研究擬以抗菌活性為指導(dǎo)分離珊瑚蘚凈的活性成分并初步研究珊瑚蘚凈的藥理作用。試驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法、微量稀釋法對(duì)珊瑚蘚凈藥敏活性進(jìn)行測(cè)定［10］，并以珊瑚蘚凈抗白色念珠菌活性為指導(dǎo)，對(duì)珊瑚蘚凈進(jìn)行分離純化，尋找其抗菌活性成分，探明其作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)掃描電鏡觀察給藥前后白色念珠菌外部形態(tài)的變化，初步了解其對(duì)白色念珠菌作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

紅色毛蘚菌(T.rubrum)ATCC294;

石膏樣毛蘚菌(Richophytion mentagrophytes)LZY8905;

白色念珠菌(Canidia Albicans)ATCC10231。

(以上菌種由中科院微生物保藏中心提供)。

1.2 試劑

正己烷、氯仿(分析純，北京化工廠);

SH1珊瑚蘚凈水煎劑提取物(自制);

L1兩性霉素B(sigma公司)。

1.3 儀器

高效液相色譜儀:Aglient 1200，Aglient Shimadzu LC-20高效液相色譜儀，

Waters HPLC2695-2487;

核磁共振儀:Bruker Avance 500MHz，Bruker AvanceⅢ400MHz，TMS 為內(nèi)標(biāo)，

2 D-NMR標(biāo)準(zhǔn)軟件—XWIN-NMR，version 2.6 software;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-52A型，上海亞榮科技有限公司;

酶標(biāo)以儀:TECNAⅡ-SAFIRE2酶標(biāo)儀，瑞士TECAN集團(tuán)公司;

真空凍干機(jī):FD-1E-80，深圳三利試驗(yàn)儀器公司;

掃描電鏡:日立S-3400N掃描電鏡。

1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，純凈水補(bǔ)齊1 000mL，121℃高壓20min。

土豆培養(yǎng)基:馬鈴薯200g沸水煮5min左右，葡萄糖20g，瓊脂16g，純凈水補(bǔ)齊1 000mL，121℃高壓滅菌20min。

沙氏培養(yǎng)基:葡萄糖20g，蛋白胨10g，瓊脂粉18g(固體)，純凈水補(bǔ)齊1 000mL，121℃高壓滅菌20min。

2 試驗(yàn)方法

2.1 珊瑚蘚凈有效成分的初步分離

將珊瑚蘚凈用8～10倍體積用氯仿反復(fù)提取，合并提取濃縮得浸膏4.729g，將所得樣品用硅膠柱層析，洗脫液為正己烷—氯仿的梯度混合溶液 (體積比10∶0～4∶6)，結(jié)合薄層層析檢測(cè)結(jié)果，合并相似成分。將得到組分用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏并稱量。

2.2 微量稀釋法測(cè)定珊瑚蘚凈抗菌活性

將硅膠柱色譜分離得到的 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四個(gè)組分用真空凍干機(jī)凍干至粉狀蒸干，并用沙氏培養(yǎng)基溶解至濃度為1 280μg/mL.并在96孔聚苯乙烯板中倍比稀釋，并分別接種白色念珠菌、紅色毛癬菌、須子樣毛癬菌懸液，使每孔終體積為100μL，48h后用肉眼直接觀察結(jié)果，小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為MIC值。

2.3 高效液相色譜(HPLC)分離Fra2主要成分

將fra2在真空凍干機(jī)凍干，用80% 甲醇溶解。溶液進(jìn)行離心(12 000r/min，15min)，取上清，用HPLC分離并收集其中主要組分。

2.4 微量稀釋法測(cè)定Z1、Z2、Z3三種化合物抗白色念珠菌活性

將得到的化合物用微量稀釋法測(cè)定對(duì)白色念珠菌的抑菌效果(試驗(yàn)方法同2.2)。

2.5 核磁共振儀鑒定化合物Z2結(jié)構(gòu)

用核磁共振儀檢測(cè)單體化合物Z2(溶劑DMSO)，通過(guò)氫譜(1H-NMR)，碳譜(13C-NMR)，DEPC-NMR，HSQC-NMR，HMBC-NMR分析Z2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.6 掃描電鏡觀察Z2對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜形態(tài)影響［11-14］

藥物在細(xì)胞膜內(nèi)與脂醇(Ergosterol)結(jié)合而造成細(xì)胞膜通透性的改變，導(dǎo)致真菌細(xì)胞內(nèi)的成分，鉀離子及其他成分如氨基酸、蛋白質(zhì)等泄漏到膜外，破壞真菌正常代謝及抑制生長(zhǎng)，細(xì)胞產(chǎn)生裂解而造成細(xì)胞死亡［11-13］。因此，擬采用本試驗(yàn)觀察珊瑚蘚凈對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜的影響。將Z2在滅菌后的24孔聚苯乙烯板中倍比稀釋，并接種白色念珠菌菌懸液使每孔終體積為200μL，將載玻片放入24孔板所示各孔孵育48h后取出并在電鏡下觀察結(jié)果［14-16］。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 珊瑚蘚凈有效成分的初步分離結(jié)果

將珊瑚蘚凈氯仿提取物用正己烷-氯仿體系進(jìn)行梯度分離，得到Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四個(gè)流分，重量分別為 0.35g、1.23g、0.58g、0.89g。

3.2 微量稀釋法測(cè)定 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4 四種組分抗真菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)ra1、Fra2、Fra3、Fra4對(duì)紅色毛蘚菌、石膏樣毛蘚菌均無(wú)明顯抗菌效果。而Fra2對(duì)白色念珠菌有明顯抑制效果，最小抑菌濃度(MIC)達(dá)到40ug/mL(見(jiàn)表1)，而珊瑚蘚凈氯仿粗提物最小抑菌濃度(MIC)為640ug/mL，因此Fra2為珊瑚蘚凈的活性成分。

表1 Fra1、Fra2、Fra3、Fra4抗白色念珠菌MIC值 (單位μg/mL)Tab.1 Fra1，F(xiàn)ra2，F(xiàn)ra3，F(xiàn)ra4 anti-candida MIC result

圖1 Fra2 HPLC結(jié)果Fig.1 Fra2 HPLCresult

3.3 高效液相色譜(HPLC)分離Fra2主要成分結(jié)果

由圖1可知，高效液相色譜在Fra2中共分離到三種主要化合物(圖中標(biāo)示為1、2、3)，收集化合物，記做 Z1、Z2、Z3，稱重得到重量分別為 85mg，121mg，32mg。

3.4 微量稀釋法測(cè)定Z1、Z2、Z3三種化合物抗白色念珠菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，化合物Z2的最小抑菌濃度(MIC)為10μg/mL，Z1、Z2均沒(méi)有明顯的抑菌效果，因此 Z2是 Fra2中的主要抑菌成分。

表2 Z1，Z2，Z3抗白色念珠菌MIC值 (單位μg/mL)Tab.2 Z1，Z2，Z3 anti-candida MIC result

3.5 核磁共振法(NMR)鑒定化合物Z2結(jié)構(gòu)

經(jīng)過(guò)NMR圖譜結(jié)果分析，Z2結(jié)構(gòu)為:

命名為 1，3，4，6-4 氨基己烷(1，3，4，6-4 amino hexane)

圖2 化合物Z2的1 H-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.2 Z2 1 H-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖3 化合物Z2的13 C-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.3 Z213 C-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖4 化合物Z2的DEPT-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.4 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

3.6 掃面電鏡觀察Fra2對(duì)白色念珠菌細(xì)胞膜的影響結(jié)果

在藥物濃度為320μg/mL時(shí)(圖7)，白色念珠菌基本死亡，電鏡下幾乎看不到白色念珠菌細(xì)胞，只能看到少量沒(méi)有生長(zhǎng)到一定體積細(xì)胞就發(fā)生破裂的白色念珠菌細(xì)胞。能看到少量散落的菌絲，細(xì)胞壁有明顯的褶皺。在藥物濃度為80μg/mL(圖8)時(shí)，在電鏡下能觀察到已經(jīng)破裂的白色念珠菌細(xì)胞和菌絲體，細(xì)胞壁有明顯褶皺，與陽(yáng)性對(duì)照兩性霉素B藥物濃度10μg/mL(圖12)下觀察到的結(jié)果相似。在藥物濃度為10μg/mL時(shí)(圖9)，在電鏡下未能觀察到已經(jīng)破裂的白色念珠菌細(xì)胞，正常存活的細(xì)胞細(xì)胞壁有明顯褶皺。在藥物濃度為5μg/m(圖10)時(shí)，在電鏡下未觀察到破裂的白色念珠菌細(xì)胞，正常存活的細(xì)胞細(xì)胞壁未出現(xiàn)褶皺，菌體表面光滑，生長(zhǎng)狀態(tài)正常，與陰性對(duì)照(圖11)觀察到的結(jié)果相似。從掃描電鏡結(jié)果可以看出，珊瑚蘚凈有效部位Fra2對(duì)白色念珠菌有明顯的抑制效果并呈現(xiàn)出對(duì)藥物的劑量依賴效應(yīng)。

圖5 化合物Z2的HSQC-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.5 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖6 化合物Z2的HMBC-NMR圖譜(DMSO-d6)Fig.6 Z2 DEPT-NMR Spectra(DMSO-d6)

圖7 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為320μg/mL)Fig.7 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level320μg/mL)

圖8 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為80μg/mL)Fig.8 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level 80μg/mL)

圖9 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為10μg/mL)Fig.9 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level10μg/mL)

圖10 白色念珠菌掃描電鏡圖(藥物濃度為5μg/mL)Fig.10 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(drug level 5μg/mL)

圖11 白色念珠菌掃描電鏡圖(陰性對(duì)照)Fig.11 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(negative control)

圖12 白色念珠菌掃描電鏡圖(兩性霉素B 10μg/mL)Fig.12 Scanning electron microscope photographs of Candida albicans(amphotericin B10μg/mL)

4 討論

珊瑚蘚凈是一種有效的抗真菌中成藥，將其用氯仿提取所得樣品再通過(guò)硅膠柱層析得到有效組分Fra2，經(jīng)微量稀釋法測(cè)定，F(xiàn)ra2對(duì)白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)值為40μg/mL，有明顯的抑菌效果。用HPLC對(duì)Fra2進(jìn)行純化得到三種主要化合物Z1、Z2、Z3，經(jīng)藥敏試驗(yàn)測(cè)定Z2最小抑菌濃度(MIC)值為10μg/mL，與珊瑚蘚凈水提劑SH1相比最小抑菌濃度提高了64倍，使藥物的作用效果顯著提高，為珊瑚蘚凈的有效作用成分。經(jīng)過(guò)NMR鑒定Z2的化學(xué)成分為1，3，4，6-4氨基己烷。通過(guò)顯微鏡、掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，從珊瑚蘚凈中得到的單體化合物Z2可以破壞白色念珠菌的細(xì)胞膜并使白色念珠菌細(xì)胞裂解死亡。研究表明，化合物Z2是以活性為指導(dǎo)從珊瑚蘚凈中得到的抗白色念珠菌有效單體，是一種潛在的抗真菌新藥。因此，對(duì)Z2進(jìn)行進(jìn)一步研究，開發(fā)治療足癬的新藥，有著十分重要的意義和廣闊的市場(chǎng)前景。

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