賈博宇，姜 波，李寶龍，劉 旭，周忠光

(黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040)

隨著人類壽命的延長，與年齡相關(guān)性疾病的發(fā)病率也顯著增加，而以腦疾病增加最為顯著［1］，其中最典型的代表疾病即為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，即人們常說的“老年性癡呆”。AD是以記憶力減退、認知功能障礙為特征的神經(jīng)退行性疾病。臨床上表現(xiàn)為學習記憶能力下降、分析判斷能力減退、情緒改變及行為失常，嚴重者可出現(xiàn)意識模糊。目前對這類疾病的治療仍具挑戰(zhàn)性，使患者及其家人感到恐慌，AD不僅嚴重影響老年人的日常生活和社會活動能力，還常常剝奪人類的精神活動功能，其病情隨時間呈進行性加重，在幾年內(nèi)便可喪失獨立生活能力。老年癡呆已經(jīng)成為現(xiàn)代社會的一個危機，被人們形象地稱為“時間炸彈”。

通天草又名地栗梗，《飲片新參》中稱之為荸薺梗，在《蘇州本產(chǎn)藥材》中稱為荸薺苗，還有一種叫法為野荸薺苗。為莎草科(Cyperaceae)植物荸薺 Heleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.ex Henschel的地上莖部分。本品性味苦、平，有化濕熱，利小便，通淋的作用，主要用來治療“呃逆”和“小便不利”等癥。本課題組經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)通天草提取物對老年性癡呆具有一定的防治作用。本研究采用醇提法和水提法，分別從通天草里提取相關(guān)可溶性物質(zhì)，分組給藥一段時間后，觀察AD大鼠模型Morris水迷宮行為學的影響，從而為開發(fā)治療阿爾茨海默癥的新藥提供新的數(shù)據(jù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 通天草提取物的制備

本研究所用通天草提取物，均在黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心試驗室利用“醇提法”和“水提法”自行提取得到。

1.1 試驗藥材來源及鑒定

1.1.1 試驗藥材來源

通天草:為莎草科(Cyperaceae)植物荸薺Heleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.ex Henschel的干燥地上莖部分。產(chǎn)地江蘇。

1.1.2 鑒定依據(jù)及結(jié)果

試驗所用全部藥材均購自于哈爾濱市藥材公司，按照1989年江蘇地方標準有關(guān)通天草的各項規(guī)定檢查，鑒定結(jié)果均符合規(guī)定。

1.2 試驗儀器設(shè)備

RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業(yè)有限公司);101-0AB型電熱恒溫鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);FA2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司);HY-02型粉碎機(北京環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司);KQ-160TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DETW型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);SHZ-IIIB型循環(huán)水真空泵(沈陽海普瑞真空設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗試劑

無水乙醇(分析純，天津天力化學試劑廠)

1.4 提取方法

1.4.1 醇提取物

精密稱取通天草400g，加10倍量(4 000mL)的80%乙醇浸泡1.5h至飽和，加熱回流提取2次，每次回流1.5h，過濾，殘渣晾干待用，合并兩次濾液，分批裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40℃ ～50℃減壓回收，乙醇待用，合并殘留藥液水浴90℃蒸干后放入干燥箱，60℃干燥得到醇提取物質(zhì)干膏，打粉待用。

1.4.2 水提取物

上一過程中過濾得到的藥材殘渣，加10倍量(4 000mL)的蒸餾水加熱回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并兩次濾液，加熱濃縮至500mL，水浴90℃蒸干，放入干燥箱60℃干燥得到水提取物質(zhì)干膏，打粉待用。

1.5 出膏率測定

試驗共計提取通天草原藥材7 013.1g。醇提法:得干膏417g，1g藥粉含原藥材 17.1469g;水提法:得干膏451.2g，1g 藥粉含原藥材 15.6229g。

2 通天草提取物對AD大鼠行為學影響的試驗研究

2.1 試驗動物

選擇4～5月齡清潔級Wistar雄性大鼠，體重220g±20g，由黑龍江中醫(yī)藥大學試驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK黑2008004。

2.2 試驗儀器設(shè)備

Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所);SN-2大鼠腦立體定位儀(日本);10ul微量進樣器(寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠);52-97型自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

2.3 試驗試劑及藥品

Aβ1-40(Sigma公司);水合氯醛(昆山);0.9%生理鹽水(哈藥集團制藥六廠);吡拉西坦片(又名腦復(fù)康片，東北制藥廠生產(chǎn)，國藥準字H21021775，產(chǎn)品批號101250;配制成含生藥0.0432g/mL水溶液，4℃保存);通天草提取物(醇低 組 0.04724g/mL;醇 高 組 0.189g/mL;水 低 組(0.05185g/mL;水高組 0.2074g/mL)。

2.4 試驗過程

2.4.1 動物篩選

大鼠在屏障系統(tǒng)內(nèi)飼養(yǎng)觀察7d后，進行Morris水迷宮測試，篩選智力正常(潛伏期≤60S)并且游泳姿勢正常的Wistar大鼠用于本次試驗。

2.4.2 動物分組

隨機選取96只經(jīng)水迷宮篩選合格大鼠，隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、醇提低劑量組、醇提高劑量組、水提低劑量組、水提高劑量組和西藥對照組，每組各12只。

2.4.3 模型復(fù)制

用0.9%無菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成濃度為5g/L的溶液，將稀釋液放置于37℃恒溫箱中7d，使Aβ1-40形成聚集肽，然后取出放入-20℃冰箱中備用。

手術(shù)器械及手術(shù)臺先用紫外線照射再用75%酒精和碘伏消毒，大鼠造模前24h禁食，腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉。將大鼠的頭部水平固定于腦立體定位儀上，去除手術(shù)區(qū)毛發(fā)并做常規(guī)消毒，然后沿矢狀線切開皮膚，切口長約2cm，向兩側(cè)推開皮膚和骨膜，找到“前囟”位置［2，3］。并經(jīng)預(yù)試驗確定顱骨上能夠到達大鼠海馬Ca1區(qū)位置的注射點及進針深度(前囟后3.5mm，中線向左旁開2mm，進針3.5mm)，用9號鋼針自制的鉆頭在注射點打孔，微量注射器自顱骨硬模下垂直進針3.5mm，然后在5min內(nèi)向腦組織內(nèi)緩慢勻速注射 Aβ1-40溶液2uL(10μg)，注射完成后留針5min，然后緩慢退針，用牙科泥封住顱骨孔，手術(shù)區(qū)撒少量青霉素消炎，縫合皮膚并用碘伏消毒，假手術(shù)組用等體積0.9%生理鹽水代替Aβ1-40溶液，空白組不作任何處理，手術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)至完全清醒。

2.4.4 給藥劑量及療程

各組大鼠造模完成后第7d開始，每日灌胃給藥1次:醇提高劑量組(1.89g/kg·d)，醇提低劑量組(0.47g/kg·d)，水提高劑量組(2.07g/kg·d)，水提低劑量組(0.52g/kg·d)，西藥組(0.43g/kg·d)，空白組、假手術(shù)組與模型組大鼠每日給予等容積0.9%無菌生理鹽水，各組療程都是28d。

2.4.5 行為學檢測

各組大鼠在造模后的第2d和給藥后第24d分別進行Morris水迷宮測試，測試方法同2.4.1，記錄大鼠潛伏期和60s內(nèi)穿過原平臺位置的次數(shù)。

2.4.6 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)組間比較使用SPSS16.0進行t檢驗，結(jié)果以±S表示。

3 試驗結(jié)果

造模后的各組AD大鼠在前4d的定位航行試驗中，游泳軌跡多表現(xiàn)為邊緣型或隨機型，空白組和假手術(shù)組部分大鼠在試驗的2～4d內(nèi)能夠憑借空間記憶找到平臺，第5d的空間搜索試驗，各組AD大鼠的空間記憶能力明顯較空白組和假手術(shù)組大鼠差，入水后仍表現(xiàn)為隨機型，而空白組和假手術(shù)組大鼠多表現(xiàn)出直線型。各給藥組大鼠經(jīng)過28d治療后，其學習記憶能力都有不同程度的改善，而模型組游泳軌跡仍表現(xiàn)出邊緣型和隨機型。

3.1 不同時期各組大鼠潛伏期的變化

造模前各組大鼠都經(jīng)過Morris水迷宮篩選，其潛伏期無差別，術(shù)后第6d所做空間搜索試驗(結(jié)果見表1、圖1)，模型組大鼠潛伏期與正常組大鼠相比差異有顯著性意義(P＜0.01)，而假手術(shù)組大鼠潛伏期與正常組大鼠相比差異無意義(P＞0.05)，說明模型復(fù)制成功且穩(wěn)定性良好。其余5個給藥組大鼠潛伏期與正常組大鼠比較，時間明顯延長，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說明大鼠產(chǎn)生了認知功能障礙，可用于本試驗。

給藥治療后第28d，空間搜索試驗(結(jié)果見表1、圖1)顯示，模型組、醇提低劑量組、水提高劑量組和水提低劑量組與空白組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間相對延長;醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間明顯縮短;水提低劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，潛伏期時間有所縮短，說明各組大鼠經(jīng)過治療后，認知功能有所提高。

表1 治療前后各組大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期的變化(±S)Tab.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze(±S)

表1 治療前后各組大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期的變化(±S)Tab.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze(±S)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別 例數(shù) 劑量(g/kg) 造模后(s) 治療后(s)空白組 12 等體積 25.08±4.64 23.08±6.59ΔΔ假手術(shù)組 12 等體積 24.33±5.60 23.42±4.62ΔΔ模型組 12 等體積 44.75±6.51＊＊ 44.67±7.80＊＊醇提高劑量組 12 1.89 44.17 ±8.90＊＊ 25.92 ±8.36ΔΔ醇提低劑量組 12 0.47 46.75 ±5.12＊＊ 34.75 ±10.31＊＊ΔΔ水提高劑量組 12 2.07 47.08 ±7.82＊＊ 32.25 ±7.46＊＊ΔΔ水提低劑量組 12 0.52 44.33 ±8.66＊＊ 38.08 ±8.35＊＊Δ西藥組 12 0.43 45.00±6.24＊＊ 25.25±6.21ΔΔ

3.2 不同時期各組大鼠穿越平臺的次數(shù)

造模后第6d所做空間搜索試驗(結(jié)果見表2、圖2)，模型組、西藥組和通天草提取物4個給藥組與正常組比較，穿越平臺次數(shù)明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0.01);而且假手術(shù)組大鼠與正常組大鼠比較差異無意義(P＞0.05)，證明模型復(fù)制成功且穩(wěn)定性良好。

圖1 治療前后各組大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期的變化Fig.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze

給藥后第28d，空間搜索試驗(結(jié)果見表2、圖2)顯示，模型組與空白組比較有顯著差異(P＜0.01)，說明模型穩(wěn)定;通天草提取物4個給藥組和西藥組與空白組比較無差異(P＞0.05);醇提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，穿越平臺次數(shù)明顯增加;醇提低劑量組、水提高劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，穿越平臺次數(shù)有所增加;水提低劑量組與模型組比較無差異(P＞0.05)，但穿越平臺次數(shù)也相對有所增加;說明各組大鼠治療后認知功能有所提高。

表2 治療前后各組大鼠穿越平臺的次數(shù)(x±S)Tab.2 The number of rats in each group through the platform before and after treatment(x±S)

4 討論

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于1981年設(shè)計并應(yīng)用于檢測大鼠空間學習記憶能力的一種常用裝置，已經(jīng)成為一種研究空間學習和記憶能力的標準模式，被廣泛應(yīng)用于與嚙齒類動物視覺相關(guān)的空間記憶和工作記憶的測量中。

通過對比不同時期各組大鼠潛伏期和穿越平臺的次數(shù)，可知造模后模型組和5個給藥組的大鼠潛伏期和穿越平臺的次數(shù)與正常組大鼠比較，時間明顯延長，次數(shù)明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說明試驗所需AD大鼠模型復(fù)制成功。治療后水迷宮試驗結(jié)果顯示，醇提低劑量組、水提高劑量組和水提低劑量組與空白組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間相對延長;醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間明顯縮短;水提低劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，潛伏期時間有所縮短;說明醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組、水提低劑量組和西藥組對提高AD大鼠認知功能都具有一定效果，其中醇提高劑量組和西藥組作用效果最強，水提低劑量組療效最差。醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組、水提低劑量組和西藥組與空白組穿越平臺次數(shù)比較無差異(P＞0.05);醇提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，穿越平臺次數(shù)明顯增加，證實醇提高劑量組和西藥組療效最好，比較其潛伏期和穿越平臺次數(shù)，發(fā)現(xiàn)醇提高劑量組治療后潛伏期為25.92±8.36，穿越平臺次數(shù)為3.17±1.59，西藥組治療后潛伏期為25.25±6.21，穿越平臺次數(shù)為 3.25 ±1.49，說明西藥組的療效略好于醇提高劑量組;醇提低劑量組、水提高劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，水提低劑量組與模型組比較無差異(P＞0.05)，但穿越平臺次數(shù)都有所增加，說明這三組藥物也具有一定的治療效果，比較其潛伏期和穿越平臺次數(shù)，發(fā)現(xiàn)水提高劑量組治療后潛伏期為32.25±7.46，穿越平臺次數(shù)為2.92±1.38，醇提低劑量組治療后潛伏期為 34.75 ±10.31，穿越平臺次數(shù)為 2.83 ±1.40，水提低劑量組治療后潛伏期為38.08±8.35，穿越平臺次數(shù)為2.58±1.17，因此推測這三組通天草提取物的藥效:水提高劑量組＞醇提低劑量組＞水提低劑量。

圖2 治療前后各組大鼠穿越平臺的次數(shù)Fig.2 The number of rats in each group through the platform before and after treatment

研究結(jié)果表明:通天草提取物對AD大鼠的空間學習記憶能力具有一定程度的改善作用。

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［3］周忠光.補陽還五湯對Aβ1-40所致AD大鼠β-淀粉樣蛋白影響及相關(guān)機制的研究［D］.黑龍江中醫(yī)藥大學，2007:16-31.