原 韜，王 鋼，谷 軍，張曉彥，于德水，沙長青，

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010;2.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150001;3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150001)

生物質(zhì)能是一種重要的可再生能源，大力發(fā)展生物質(zhì)能源，逐步取代傳統(tǒng)不可再生能源勢在必行。木質(zhì)纖維原料是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。木質(zhì)纖維原料中纖維素及半纖維素約占干重的60% ～85%，纖維素、半纖維素經(jīng)酶學(xué)降解生產(chǎn)單糖是公認(rèn)的最理想的轉(zhuǎn)化方法［1］。因此，纖維素酶和半纖維素酶的研究一直是生物學(xué)領(lǐng)域的重要課題之一。

自然界微生物對木質(zhì)纖維的降解是一個緩慢的過程，雖然對木質(zhì)纖維有較完整和徹底的降解能力，但降解效率卻并不高，使之成為木質(zhì)纖維材料利用的限速步驟和瓶頸環(huán)節(jié)。而白蟻由于自身對生長養(yǎng)分來源的需求［2-5］，其內(nèi)外源木質(zhì)纖維酶的開發(fā)被認(rèn)為是大量轉(zhuǎn)化和利用木質(zhì)纖維生物能源的重要參考途徑［6］。

在研究白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶的過程中仍存在著許多問題有待解決，其中與傳統(tǒng)微生物產(chǎn)纖維素、半纖維素酶的克隆表達不同，白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶區(qū)別于細(xì)菌、真菌內(nèi)源酶，是一種昆蟲內(nèi)源酶，其合成后修飾系統(tǒng)區(qū)別于大腸桿菌、酵母菌等傳統(tǒng)表達［7，8］，利用這種傳統(tǒng)微生物表達體系進行白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶的克隆和表達，很難保證表達產(chǎn)生的酶蛋白具有原始活性。因此，在白蟻內(nèi)源酶蛋白表達過程中，需要一種接近白蟻自身蛋白表達加工的高效表達體系［9］。

昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)利用昆蟲桿狀病毒作為傳遞媒介，可將外源蛋白基因整合在昆蟲桿狀病毒基因組中，并保證病毒的完整性，經(jīng)過病毒的包裝和侵染，外源基因進入昆蟲細(xì)胞，利用病毒自身的中晚期強啟動子，在昆蟲細(xì)胞中高效表達外源蛋白基因，桿狀病毒的宿主范圍僅限于昆蟲和少數(shù)其他無脊椎動物，其專一性使其對人和哺乳動物是安全的。桿狀病毒除個別基因外絕大多數(shù)基因無剪接作用，能夠最大程度保證外源基因的功能。

本研究以白蟻為目標(biāo)，克隆白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶基因，利用昆蟲桿狀病毒表達體系構(gòu)建重組桿狀病毒，經(jīng)過轉(zhuǎn)染、擴毒，利用昆蟲細(xì)胞高效表達白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶，最大程度接近白蟻自身內(nèi)源木質(zhì)纖維酶的表達環(huán)境，為提高表達產(chǎn)物活性提供最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

E.coli DH5α、DH10Bac 由本課題組保藏;E.coli DH5α用于克隆轉(zhuǎn)化，E.coli DH10Bac用于重組桿狀病毒構(gòu)建;Bac-to-Bac系統(tǒng)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1，由黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院饋贈;克隆載體pMD18-T Vector，購自大連寶生物工程有限公司。

圖1 攜帶白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶重組桿狀病毒構(gòu)建圖Fig.1 Map of recombinant baculovirus construction of termite wood fibre enzyme

1.1.2 擴增引物

參照GenBank中收錄的Odontotermes formosanus EG酶(GU326330.1)序列，通過比較分析，應(yīng)用生物軟件 Primer5.0設(shè)計引物，擴增約1.7kb的EG酶基因(表1)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.3 工具酶及試劑

Taq plus，rTaq酶購自天根生化科技有限公司;Bam HⅠ、Eco RⅠ、HindⅢ，T4DNA連接酶，RNA酶，蛋白酶 K購自寶生物工程有限公司;Sf900ⅡSFM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清(Cat.No.A15-043)購自PAA公司;胰蛋白酶購自寶生物工程有限公司;Sf900ⅡSFM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;低熔點瓊脂糖購自Promega公司;Cellfectin? Reagent購自 Invitrogen公司;Reverse Transcription System購自Promega公司;小量膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)購自華舜生物試劑公司。LB液體、固體培養(yǎng)基;SOB培養(yǎng)基;SOC培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 TRIzol法提取白蟻基因組RNA

在解剖鏡下提取白蟻的唾液腺:50～100mg唾液腺加入400μL TRIzol，充分振勻后室溫靜置8min;加入80μL的氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5min，然后10 000 r/min、4℃離心15min;取上清加50%終體積的異丙醇于-20℃沉淀1 ～2h，然后12 000r/min、4℃離心 15min;棄上清，用 200μL預(yù)冷的75%乙醇漂洗，12 000r/min、4℃離心15min;棄上清，干燥后用20μL DEPC水重懸，稀釋適當(dāng)倍數(shù)用紫外分光光度計測定RNA的濃度后備用。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)

在PCR管中準(zhǔn)備以下RNA引物混合物:病毒RNA 1μg反轉(zhuǎn)錄引物 1μL，DEPC 處理水補加至 10.75μL，其中反轉(zhuǎn)錄引物為P1。70℃ 3min、冰浴5min;按順序在PCR管中加入以下試劑:10 ×buffer 2μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTP Mixture(10mM)2μL 共8μL，加入 Recombinant Inhibitor 0.5μL 和 RT 酶 0.75μL;48℃ 40min;95℃加熱 5min，冰浴 5min，-20℃保存［10］。

1.2.3 PCR擴增 EG 基因

50 μL PCR反應(yīng)體系，PCR管中依次加入下列組分10×Taq Plus Buffer(Mg2+)5μL，dNTP Mixture 0.8mmol/L，primer各0.4μmol/L，Taq Plus DNA Polymerase 0.5μL，模板DNA 1μL，以P1、P2為引物，進行PCR反應(yīng):1個循環(huán)94℃120s;30個循環(huán) 98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 90s;1個循環(huán)72℃ 600s。取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，與1μL 10×Loading buffer混合均勻，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物膠回收與T-Vector連接

PCR產(chǎn)物用上海華舜生物工程有限公司DNA膠回收試劑盒(Gel Extraction Mini Kit)進行回收。將純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T在16℃連接過夜，反應(yīng)體系見載體說明書。

1.2.5 利用Bac-to-Bac體系構(gòu)建重組Bacmid-EG

1.2.5.1 連接片段的制備與連接

用HindⅢ和EcoRⅠ對pFastBac1轉(zhuǎn)移載體和p18EG1分別進行雙酶切。反應(yīng)條件為37℃水浴作用2h。根據(jù)膠回收目的條帶時各產(chǎn)物的濃度，按照插入片段和載體的摩爾濃度比為5∶1進行連接，16℃連接過夜。

1.2.5.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastBac1的篩選

取2μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，其中使用的LB瓊脂平板含氨芐青霉素(終濃度為100μg/mL)，不含IPTG和X-gal。37℃培養(yǎng)過夜，挑取抗性菌落接種在5mL LB液體培養(yǎng)基(100μg/mL Amp)中，37℃振蕩培養(yǎng)12～14h。用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。

1.2.5.3 重組 Bacmid DNA 的 PCR鑒定

以100ng重組Bacmid DNA為模板，以P1和P2為引物，對重組Bacmid DNA進行PCR鑒定。將含有EG基因的重組Bacmid命名為Bacmid-EG。

1.2.6 帶有EG基因重組桿狀病毒的構(gòu)建

1.2.6.1 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞

將生長狀態(tài)良好的Sf9細(xì)胞，以1 000r/min離心5min，棄上清，細(xì)胞沉淀用新鮮的SF900ⅡSFM培養(yǎng)液(含50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素)重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至4.5×105個/mL，每孔加入2mL接于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。細(xì)胞貼壁1h后，即可以轉(zhuǎn)染;將重組bacmid DNA與轉(zhuǎn)染試劑于Eppendorf管中混合:

a.將1μg重組 bacmid DNA 用 100μL SF900ⅡSFM 培養(yǎng)液稀釋。

b.用前將轉(zhuǎn)染試劑(Cellfectin? Reagent)翻轉(zhuǎn)5～10次，使之混勻。取6μL轉(zhuǎn)染試劑用100μL SF900ⅡSFM培養(yǎng)液稀釋。

c.將稀釋的重組bacmid DNA和轉(zhuǎn)染試劑混勻，制備DNA-脂質(zhì)體混合物(總體積約為210μL)。室溫靜置15～45min。

棄去Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)液，用2mL SF900ⅡSFM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，棄去洗滌培養(yǎng)液;向含有DNA-脂質(zhì)體混合物的各個Eppendorf管中加入0.8mL SF900ⅡSFM培養(yǎng)液，溫和混勻，分別加入每個細(xì)胞培養(yǎng)孔中，27℃作用5h;移出DNA-脂質(zhì)體混合物，向細(xì)胞中加入2mL SF900ⅡSFM培養(yǎng)液(含50U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素)，27℃培養(yǎng)直至細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變效應(yīng)。

1.2.6.2 重組桿狀病毒DNA的提取

將1mL病毒液以5 000r/min，4℃離心10min，沉淀細(xì)胞碎片，吸取上清至一新的離心管中，18 000r/min、4℃離心2h，棄去上清，用50μL TEN緩沖液重懸病毒沉淀;加入蛋白酶K(20mg/mL)至終濃度為1mg/mL和10%SDS至終濃度為0.5%，50℃溫浴2h;加入等體積酚/異戊醇(25/1)，混勻，室溫3min，12 000r/min、4℃離心5min;上清移至一新的離心管中，加入等體積氯仿，上下顛倒混勻，室溫3min，12 000r/min，4℃離心5min;上清移至一新的離心管中，加入1/10體積預(yù)冷3M NaAC和等體積預(yù)冷異丙醇，-20℃靜置2h沉淀DNA;12 000r/min、4℃離心15min，棄上清，用100μL預(yù)冷 75%乙醇漂洗沉淀，12 000r/min、4℃ 離心15min，棄上清，用 10μL ddH2O 重懸 DNA 沉淀，-20℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 EG基因的反轉(zhuǎn)錄及PCR擴增

以P1、P2為引物，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板，對EG基因進行PCR擴增，其擴增結(jié)果見圖2，約1.7kb電泳帶為PCR擴增產(chǎn)物。

圖2 EG基因的PCR結(jié)果1 EG基因的PCR產(chǎn)物;2 DNA Marker DL15 000.Fig.2 The PCR result of EG;1 PCR product of EG;2 DNA Marker DL15 000.

2.2 p18EG1重組子的鑒定

EG基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接于pMD18-T載體以P1和P2為引物做PCR鑒定陽性克隆，擴增產(chǎn)物大小約在1.7kb處，與預(yù)期大小相符，結(jié)果見圖3。

2.3 EG連于pMD18-T載體方向鑒定

根據(jù)后續(xù)重組質(zhì)粒pFastBac1的構(gòu)建策略(如圖4)，選擇pFastBac1和pMD18-T載體共有的EcoRⅠ和HindⅢ兩個酶切位點作為連接位點。由于“T-A”克隆是非定向克隆，所以EG片段可能以“正向”和“反向”兩種方向連接到pMD18-T載體上，這里“正向”規(guī)定為EG基因的起始密碼子ATG靠近pMD18-T載體多克隆位點中的EcoRⅠ位點，相反則為“反向”。依據(jù)構(gòu)建策略要求，EG基因反向連接于pMD18-T載體才能使EG的表達方向與pFastBac1質(zhì)粒載體上的PPH啟動子方向一致。所以需要篩選反向連接于pMD18-T載體上的EG陽性克隆。

在EG基因中，位于1 316bp處具有EcoRⅠ單一酶切位點，而且pMD18-T載體多克隆位點中也具有BamHⅠ單一酶切位點。若經(jīng)BamHⅠ單酶切，反向連接的p18EG1克隆應(yīng)該切出約450bp和4 000bp兩條條帶，正向連接的VP2克隆應(yīng)該切出約1 316bp和3 100bp兩條條帶。選取2個p18EG重組子，分別命名1、2，分別用BamHⅠ單酶切，結(jié)果1切出兩條約為1 316bp和3 100bp的條帶，結(jié)果2切出兩條約為450bp和4 000bp的條帶。同時使用EcoRⅠ和HindⅢ兩個酶對1、2兩組質(zhì)粒進行雙酶切，結(jié)果都出現(xiàn)了與EG基因相符的約1.7kb的條帶和與pMD18-T質(zhì)粒大小相符的約2.7kb的條帶。(如圖5)，說明1號為EG正向連接的陽性克隆，2號為反向連接的陽性克隆。

圖3 p18EG的鑒定結(jié)果1-6 p18EG1重組質(zhì)粒電泳結(jié)果;7 DNA Marker DL15 000;8 p18EG的PCR鑒定結(jié)果。Fig.3 The identification result of p18EG 1-6 plasmid;7 DNA Marker DL15 000;8 PCR amplification of p18EG.

圖4 構(gòu)建重組質(zhì)粒p18EGFig.4 The construction of recombinant plasmid p18EG

2.4 攜帶EG基因重組Bacmid的構(gòu)建

2.4.1 黏性末端pFastBac1和EG基因片段的制備

pFastBac1-EG的構(gòu)建策略如圖4所示。對pFastBac1轉(zhuǎn)移質(zhì)粒和p18EG1分別進行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，分別膠回收pFastBac1質(zhì)粒載體(4.8kb)和EG基因(1.7kb)的目的條帶，結(jié)果見圖6。

圖5 p18EG的鑒定結(jié)果1 DNA Marker DL2 000;2，3 Bam HI單酶切產(chǎn)物;4，5 EcoRI和HindⅢ雙酶切產(chǎn)物。Fig.5 The identification result of p18EG 1 DNA Marker DL2 000;2，3 Product digested with Bam HI;4，5 Product digested with EcoRI and HindⅢ.

圖6 pFastBac1、p18EG1雙酶切膠回收結(jié)果1DNA Marker DL15 000;2 p18EG的EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切膠回收產(chǎn)物;3 pFastBac1的EocRⅠ和HindⅢ雙酶切膠回收產(chǎn)物。Fig.6 The gel extraction result of pFastBac1 and p18EG1 1DNA Marker DL15 000;2 Gel extraction product of pFastBac1 digested with EcoRⅠand HindⅢ.3Gel extraction product of pFastBac1 digested with EcoRⅠand HindⅢ.

2.4.2 含有EG基因重組Bacmid的鑒定

重組質(zhì)粒pFBEG1轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取重組Bacmid DNA，以P1和P2為引物對其進行PCR鑒定，擴增產(chǎn)物約在1.7kb處，與預(yù)期大小相符，結(jié)果見圖7。

2.5 重組桿狀病毒的構(gòu)建

2.5.1 Sf9昆蟲細(xì)胞正常及病變形態(tài)區(qū)別

利用倒置顯微鏡觀察正常Sf9昆蟲細(xì)胞及重組Bacmid-EG轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞病變，生長良好的Sf9昆蟲細(xì)胞呈現(xiàn)圓形、明亮且邊緣整齊，觀察病變細(xì)胞初期(轉(zhuǎn)染后3～5d)出現(xiàn)細(xì)胞體積變大，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)顆粒，后期(轉(zhuǎn)染后7～10d)病變細(xì)胞破裂，結(jié)果見圖8。

圖7 重組Bacmid的PCR鑒定結(jié)果1-2重組Bacmid的PCR產(chǎn)物;3 DNA Marker DL15 000。Fig.7 The PCR identification of recombinant Bacmid 1-2 PCR product of recombinant Bacmid;3 DNA Marker DL15 000.

圖8 不同狀態(tài)的Sf9細(xì)胞(40×)(a)正常狀態(tài)的Sf9細(xì)胞;(b)重組病毒感染后的Sf9細(xì)胞4d;(c)重組病毒感染后的Sf9細(xì)胞9d。Fig.8 The different states of Sf9 cells(40 × )(a)Normal Sf9 cells;(b)Pathological Sf9 cells infected by recombinant baculovirus after 4days;(c)Pathological Sf9 cells infected by recombinant baculovirus after 9 days.

2.5.2 帶有EG基因重組桿狀病毒的鑒定

重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞后，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變效應(yīng)時收獲上清即為重組桿狀病毒，以P1和P2為引物PCR鑒定帶有EG基因重組桿狀病毒的DNA，其擴增產(chǎn)物大小為1.7kb，與預(yù)期相符，結(jié)果見圖9。

3 討論

圖9 F重組桿狀病毒PCR鑒定1 DNA Maker DL15 000;2-7重組桿狀病毒PCR產(chǎn)物;8未攜帶EG基因的重組桿狀病毒PCR產(chǎn)物。Fig.9 PCR analysis of F recombinant baculovirus 1 DNA Maker DL15 000;2-7 The PCR product of EG recombinant baculovirus;8 The PCR product of baculovirus without EG.

目前國內(nèi)外對白蟻木質(zhì)纖維消化能力的研究主要集中在對內(nèi)源相關(guān)酶系的克隆、表達及功能鑒定、白蟻共生生物木質(zhì)纖維酶及共同代謝機制的研究。國內(nèi)對白蟻木質(zhì)纖維消化的研究起步較晚，但目前已成為學(xué)術(shù)界的研究熱點，近年來有多篇該方向的綜述性論文相繼發(fā)表，已有報道克隆得到了部分白蟻腸道纖維素酶基因并在菌體中表達。本研究從內(nèi)源角度對白蟻自身產(chǎn)生的木質(zhì)纖維酶基因進行克隆、鑒定、Bac-to-Bac重組構(gòu)建、擴增病毒、昆蟲細(xì)胞表達，證明了昆蟲桿狀病毒細(xì)胞表達體系能夠成功攜帶白蟻內(nèi)源木質(zhì)纖維酶基因。為今后繼續(xù)開展以白蟻作為模式生物開展木質(zhì)纖維降解研究，充分利用秸稈等可再生木質(zhì)纖維資源為底物，尋找高效、低成本的木質(zhì)纖維轉(zhuǎn)化體系，解決木質(zhì)纖維生產(chǎn)乙醇等可再生能源過程中存在的瓶頸問題，以及我國面臨的經(jīng)濟增長和環(huán)境保護的雙重壓力、建立可持續(xù)發(fā)展能源系統(tǒng)、促進社會經(jīng)濟的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善具有十分重要的現(xiàn)實意義和深遠的歷史意義。

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