劉 璐， 劉 健

（合肥工業(yè)大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

肥大細胞在人體內(nèi)參與傷口愈合、血管發(fā)生、天然免疫和獲得性免疫，目前研究表明，肥大細胞在多發(fā)性硬化、風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、主動脈瘤、癌癥以及飲食導致的肥胖和糖尿病等疾病中起重要作用［1］。成熟的肥大細胞通過脫顆粒分泌大量生物活性物質(zhì)，包括生物胺類（如組胺和血清素）、細胞因子（如腫瘤壞死因子等）、絲甘蛋白聚糖、多種溶酶體酶和一系列特異的肥大細胞蛋白酶（mast cell protease，簡稱MCP，如類糜蛋白酶、類胰蛋白酶、羧肽酶A）。當肥大細胞被誘導脫顆粒，這些介質(zhì)就會隨之釋放，其中MCP占肥大細胞分泌蛋白總量25%以上。

在這些MCP中，類糜蛋白酶能誘導嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞聚集［2］，從而引起微血管通透性增強［3］，通過選擇性酶解基質(zhì)蛋白，激活蛋白酶受體，激活基質(zhì)金屬蛋白酶促進組織重建［4］，在過敏性疾病（如哮喘、特應性皮炎等）炎癥發(fā)生發(fā)展中起促進作用［5－6］，并與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［7］。在小鼠體內(nèi)，肥大細胞表達多種類糜蛋白酶（mMCP－1，mMCP－2，mMCP－4，mMCP－5，mMCP－9），mMCP－4的底物特異性高度相似于人的類糜蛋白酶，并且在小鼠體內(nèi)組織的分布和人體類糜蛋白酶相似，所以小鼠mMCP－4可認為是最接近人體類糜蛋白酶的同系物，可以用mMCP－4在小鼠體內(nèi)的作用推斷人體類糜蛋白酶的相關作用［8］。

為進一步研究mMCP－4的生物學活性及其與各種疾病的關系，本文將mMCP－4克隆到原核表達載體pET28a，利用大腸桿菌系統(tǒng)表達獲得重組蛋白mMCP－4。使用純化后的重組蛋白免疫兔子，制備mMCP－4多克隆抗體，并對獲得的多克隆抗體的效價和專一性進行鑒定和分析。

1 材料與方法

1.1 材料與實驗動物

刀豆素、PEG8000、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自SIGMA公司；蛋白定量試劑盒、氯仿、異丙醇、乙醇購自國藥公司；RNAiso Plus、RT－PCR試劑盒、BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶、Solution I連接酶購自TAKARA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen公司；IPTG購自上海生工公司；羊抗兔IgG－HRP購自 KPI公司；AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit購自AXYGEN公司；RPMI MediuM1640購自Gibco公司；Ni SepharoseTMHigh Performance購自GE公司；HRP－DAB顯色試劑盒、Super Singnal West Pico化學發(fā)光底物購自Thermo公司；感受態(tài)JM109、大腸桿菌BL21（DE3）、質(zhì)粒pET28a由本實驗室保藏。

C57BL／6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，新西蘭大白兔購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 脾細胞及小鼠cDNA的制備

取健康8周大C57BL／6小鼠的脾細胞，用RPMI1640培養(yǎng)基（含有10%FBS，1%雙抗，25mg／L刀豆素）37℃培養(yǎng)24h。根據(jù)總RNA提取試劑盒提取刀豆素刺激后的脾細胞總RNA，以Oligo d（T）18Primers為引物，M－MLV為逆轉(zhuǎn)錄酶，合成小鼠cDNA，置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設計與合成

根據(jù)GenBank發(fā)表的小鼠 MCP－4mRNA序列（登錄號為NM－010779）設計嵌套引物，預期擴增長度為709bp。

正義引物為：

反義引物為：

分別在引物P2、P3兩端加入BamH I和Xho I的酶切位點。

1.2.3 PCR擴增 mMCP－4

獲得的cDNA 0.2μL，10×PCR Buffer 2.5μL，引物P1（10μmol／L）和P3（10μmol／L）各1μL，2.5mmol／L dNTP 2.5μL，Taq DNA Polymerase 0.2μL，加DW 補至25μL，混勻。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃30s，54℃30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min，得到一次PCR產(chǎn)物。

一次PCR產(chǎn)物1μL，10×PCR Buffer 5μL，引物P2（10μmol／L）和P3（10μmol／L）各2μL，2.5mmol／L dNTP 4μL，Taq DNA Polymerase 0.4μL，加DW補至50μL，混勻。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，30個循環(huán)，72℃延伸10min，得到二次PCR產(chǎn)物。

1.2.4 構建原核表達載體pET28a－mMCP－4

凝膠回收試劑盒（AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit）回收二次PCR產(chǎn)物并計算其質(zhì)量濃度。用BamH I和XhoI限制性內(nèi)切酶對膠回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a進行酶切，37℃放置3～4h。膠回收酶切好的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET28a，16℃連接過夜。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，把染化后的菌液涂在含有卡拉霉素（Ka－na）抗性的培養(yǎng)板上，37℃過夜。RT－PCR和雙酶切鑒定獲得重組質(zhì)粒pET28a－mMCP－4，送Invitrogen公司進行測序獲得陽性克隆［9］。

1.2.5 mMCP－4融合蛋白的表達及純化

重組質(zhì)粒pET28a－mMCP－4轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑陽性菌落接入到3mL含有Kana（30μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，200r／min，37℃培養(yǎng)過夜。第2天，將菌液按1∶100的比例接入3mL含有Kana（30μg／mL）的LB培養(yǎng)基，進行小規(guī)模誘導，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按1∶1 000向其中加入0.8mol／L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導4～6h。分別取相當于0.2OD550的菌液，離心后重懸于SDS－PAGE上樣緩沖液中，100℃煮沸變性10min，進行SDSPAGE電泳檢測mMCP－4是否表達。小規(guī)模誘導檢測重組質(zhì)粒pET28a－mMCP－4在BL21中成功表達后，大規(guī)模誘導，菌液4℃12 000g離心后重懸于pH值為7.4的Tris－HCl，超聲破碎菌液，工作5s，間歇15s，重復40次，4℃12 000g離心20min，棄上清。將沉淀用Tris－HCl洗3次，沉淀 重 懸 于 裂 解 液 （50mmol／L Tris－HCl，0.3mol／LNaCl，6mol／L尿素，5mmol／L咪唑，pH值為7.4）中，4℃保存過夜。裂解液4℃12 000g離心30min，取上清液用過濾器過濾后，用Ni親和層析柱純化蛋白，SDS－PAGE檢測。

1.2.6 兔抗mMCP－4抗體的制備及效價測定

純化好的重組蛋白（約1mg）與弗氏完全佐劑按照1∶1的體積比混勻，進行皮下多點注射。14d后以等量蛋白和等體積弗氏不完全佐劑加強免疫，后每2周加強1次。第4次加強免疫10d后，在兔子耳緣靜脈取血0.5～1mL，分離抗血清［10］。用純化的 mMCP－4重組蛋白包被ELISA反應板，利用ELISA法測定抗體效價，其中一抗為倍比稀釋的免疫后兔血清，陰性對照為免疫前兔血清。效價達到1∶100 000以上時，經(jīng)頸動脈放血，收集血清，分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 western blot檢測抗體特異性

提取小鼠腹膜肥大細胞總蛋白，經(jīng)SDSPAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，4℃封閉過夜，一抗為制備的兔抗血清（1∶5 000），37℃反應1h，PBST洗5次，每次5min，二抗為辣根過氧化物酶標記（HRP）的羊抗兔抗體（1∶3 000），37℃反應1h，PBST洗5次，每次5min。加化學發(fā)光底物反應后拍照［11］。

2 結果與討論

2.1 pET28a－mMCP－4的構建

以小鼠脾細胞cDNA為模板，通過RT－PCR擴增目的基因 mMCP－4（709bp），將其重組入表達載體pET28a后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109。重組質(zhì)粒RT－PCR和BamH I、Xho I雙酶切鑒定結果如圖1所示。

圖1中，M為DNA標記；1代表BamH I、XhoI雙酶切重組質(zhì)粒；2代表重組質(zhì)粒經(jīng)RTPCR鑒定的目的條帶。

從圖1可看出，第1泳道和第2泳道均出現(xiàn)約700bp的預期片段，說明獲得重組質(zhì)粒。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去測序，序列正確的重組質(zhì)粒命名為pET8a－mMCP－4。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切和RT－PCR鑒定

2.2 融合蛋白的表達與純化

構建的重組表達載體成功轉(zhuǎn)化為大腸桿菌BL21后，挑取單菌落搖菌，菌液按1∶100接種于LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數(shù)期時加IPTG誘導，收集未誘導和分別誘導2、4、6h后的菌液樣品，SDS－PAGE電泳檢測如圖2所示。

圖2a中，M為蛋白標記；1代表未誘導；2～4分別代表加IPTG誘導2、4、6h；圖2b中，M為蛋白標記；1代表純化的mMCP－4重組蛋白；2代表破碎后沉淀；3代表表達細菌總蛋白。

從圖2可以看出，檢測泳道與對照泳道相比，泳道2、3、4都出現(xiàn)與預期28.7kDa大致相符的特異性條帶，且在4h時表達量最大。表達的重組蛋白主要以包涵體形式存在于超聲破碎后的沉淀中，將包涵體溶于裂解液中，通過Ni親和層析柱分離，最終獲得用于抗體制備的重組蛋白mMCP－4。

圖2 重組蛋白在大腸桿菌中的表達情況及其純化

2.3 ELISA法檢測抗血清效價

每孔用2pmol／L的mMCP－4重組蛋白作為抗原包被酶標板，2%脫脂奶粉封閉，將抗血清按1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000稀釋后加入酶標板孵育。洗滌后加入HRP標記的羊抗兔為二抗，最后以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物，顯色后測定450nm波長的吸光度。以免疫前血清為對照，每個稀釋度重復3次，免疫后血清吸光度與免疫前血清吸光度的比值大于2.1，且免疫后血清吸光度大于0.4為陽性。mMCP－4抗體ELISA效價如圖3所示。圖3表明，制備的抗血清效價達1∶128 000。

圖3 mMCP－4抗體ELISA效價

2.4 western blot檢測

為檢測制備的抗血清特異性，提取小鼠腹膜肥大細胞蛋白進行western blot檢測，其檢測結果如圖4所示，圖4中，1、2為小鼠腹膜肥大細胞；3、4為小鼠肝癌細胞H22。以小鼠肝癌細胞H22作為陰性對照，制備的兔抗血清為一抗，HRP標記的羊抗兔抗體為二抗。由圖4可知，抗血清能識別小鼠腹膜肥大細胞中的蛋白，而在肝癌細胞H22中無明顯反應，說明所制備的抗體具有較好的特異性。

圖4 western blot檢測抗血清特異性

3 討 論

目前，外源蛋白的表達系統(tǒng)有很多，其中大腸桿菌表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉、表達量大、易于純化及易于工業(yè)化批量生產(chǎn)等優(yōu)點。實驗中刀豆素誘導鼠脾細胞能表達較高水平的mMCP－4，通過RT－PCR擴增出目的基因，通過BamH I和Xho I切點整合入pET28a質(zhì)粒，成功構建重組表達載體pET28a－mMCP－4，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21。經(jīng)IPTG誘導BL21表達融合蛋白，超聲破碎后，通過SDS－PAGE鑒定在28.7kDa處有明顯的特異蛋白條帶，利用Ni親和層析柱純化含有his－tag的mMCP－4蛋白。

制備抗體需要獲得高純度的目的蛋白，本研究以純化的重組蛋白mMCP－4作為抗原，既可提高抗原的純度，也使其制備抗體時有較高的免疫原性，且選用了免疫周期長、少量多次免疫兔子，更有利于制備高特異性、高效價的mMCP－4多克隆抗體。獲得的兔抗血清，ELISA測其效價達1∶128 000。提取小鼠腹膜肥大細胞總蛋白進行western blot檢測mMCP－4多克隆抗體的專一性，結果只出現(xiàn)一條特異性條帶，說明制備的多克隆抗體具有較好的特異性。

人肥大細胞分泌的類糜蛋白在多種疾病中起重要作用，研究表明，它是變態(tài)反應性疾病和心血管疾病一個新的治療靶點。在小鼠體內(nèi)通過缺失MCP－4產(chǎn)生 MCP－4－／－小鼠，證明 mMCP－4在過敏性器官反應中能中和肥大細胞的有害作用［12］，并且mMCP－4缺失后小鼠腹主動脈瘤形成受到抑制［13］。本實驗mMCP－4重組蛋白的成功表達及其多克隆抗體的制備，為建立較方便的免疫學檢測方法及探求mMCP－4在鼠體內(nèi)的生物學功能奠定了基礎。

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