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        細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)法 (cell-ELA) 測(cè)定特異結(jié)合U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的適配子的親和力

        2013-09-03 19:18:54譚燕梁惠玉伍錫棟高宇博張興梅
        生物工程學(xué)報(bào) 2013年5期
        關(guān)鍵詞:配子生物素文庫(kù)

        譚燕,梁惠玉,伍錫棟,高宇博,張興梅

        1 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)教研室,廣東 廣州 5105152 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510515

        細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)法 (cell-ELA) 測(cè)定特異結(jié)合U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的適配子的親和力

        譚燕1,梁惠玉1,伍錫棟1,高宇博2,張興梅1

        1 南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 神經(jīng)生物學(xué)教研室,廣東 廣州 510515
        2 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510515

        譚燕, 梁惠玉, 伍錫棟, 等. 細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)法 (cell-ELA) 測(cè)定特異結(jié)合 U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的適配子的親和力. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(5): 664?671.

        Tan Y, Liang HY, Wu XD, et al. Cell-ELA-based determination of binding affinity of DNA aptamer against U87-EGFRvIII cell. Chin J Biotech, 2013, 29(5): 664?671.

        通過(guò)細(xì)胞-指數(shù)級(jí)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化 (Cell based systematic evolution of ligands by exponential enrichment,cell-SELEX) 方法從隨機(jī)文庫(kù)中篩選得到與穩(wěn)定過(guò)表達(dá)人表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體(Epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRvⅢ) 的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞株 (U87-EGFRvⅢ) 特異結(jié)合的DNA適配子。以U87-EGFRvⅢ細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象,篩選到的適配子A15作為檢測(cè)分子,建立一種細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng) (Cell enzyme-linked assay,cell-ELA) 方法測(cè)定適配子的親和力,并用EGFR抗體作為對(duì)照來(lái)比較此種DNA適配子的親和力。結(jié)果顯示,所測(cè)定的 DNA適配子 A15的解離平衡常數(shù) (Equilibrium dissociation constants,Kd) 小于100 nmol/L,對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的結(jié)合能力與抗體相似。Cell-ELA法可較方便地用于cell-SELEX中適配子親和力的測(cè)定。

        細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)法,細(xì)胞-指數(shù)級(jí)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化,DNA適配子,解離平衡常數(shù)

        適配子是一類(lèi)與靶分子特異結(jié)合的能形成穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的寡核苷酸分子。人工篩選得到的適配子有許多優(yōu)于抗體的特點(diǎn)[1-4]:1) 通過(guò)各種SELEX技術(shù)獲得,方法簡(jiǎn)單可行,并能在體外大量合成;2) 與靶分子具有較高的親和力,解離平衡常數(shù)Kd值在pmol/L~nmol/L范圍內(nèi);3) 免疫原性低;4) 易合成、保存和修飾,因此可應(yīng)用于疾病的診斷和治療。經(jīng)過(guò) 20余年的研究,SELEX技術(shù)得到了改進(jìn)和發(fā)展。近年來(lái),cell-SELEX技術(shù)發(fā)展迅速,用活細(xì)胞或者活細(xì)胞上的某些生物分子作為靶標(biāo),在生理狀態(tài)下篩選到的適配子更有意義,這將為腫瘤細(xì)胞表面特異生物標(biāo)志物的篩選提供平臺(tái)。

        在 cell-SELEX篩選中需要用合適的方法來(lái)鑒定適配子是否富集;富集得到的適配子也需要合適的方法來(lái)測(cè)定其與細(xì)胞的親和力。本研究利用經(jīng)典ELISA的方法和生物素-鏈親和素系統(tǒng),建立并進(jìn)行 cell-ELA實(shí)驗(yàn)來(lái)定量鑒定適配子與靶細(xì)胞的親和力,為 cell-SELEX篩選得到的適配子的親和力檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        HEK293、U87以及穩(wěn)定過(guò)表達(dá) EGFRvⅢ的 U87-EGFRvⅢ細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存,SH-SY5Y細(xì)胞株從ATCC (美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)) 購(gòu)買(mǎi)。PCR用的DNATaq酶購(gòu)自TaKaRa公司;DNA文庫(kù)、測(cè)序及探針標(biāo)記引物由Invitrogen公司合成;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素 (1∶1 000) 購(gòu)自Sigma公司,抗EGFR蛋白抗體 (兔多克隆抗體) 購(gòu)自Santa Cruz公司;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀為 VICTOR?X3 Multilabel Plate Reader,購(gòu)自 PerkinElmer公司;Mastercycler梯度PCR儀器為Eppendorf公司產(chǎn)品;熒光顯微鏡型號(hào)為Olympus MX7600。細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自Corning公司;96孔酶標(biāo)板購(gòu)自Costar公司。

        1.2 方法

        1.2.1 生物素或FITC標(biāo)記的DNA適配子A15的制備

        圖1 適配子A15的篩選過(guò)程[7] (DNA文庫(kù)與對(duì)照細(xì)胞 (紅色) 孵育后,將與之不結(jié)合的 DNA (灰色) 再與靶細(xì)胞 (綠色) 孵育,得到與靶細(xì)胞結(jié)合的 DNA(黃色),通過(guò)不對(duì)稱PCR大量擴(kuò)增獲得DNA單鏈,即為亞庫(kù),接著進(jìn)行下一輪篩選)Fig. 1 The procedure of cell-SELEX[7]. In cell-SELEX,a DNA library is first incubated with a non-target cell(shown in red) in a counter-selection step. Non-specific membrane proteins are shown in grey. Unbound aptamers are then recovered and incubated with the target cell (shown in green), which may express either a particular target (specific target membrane proteins shown in color) or target cell type. Bound aptamers(yellow) are recovered by phenol extraction and amplified via asymmetrical PCR.

        通過(guò)cell-SELEX的方法 (圖1) 從隨機(jī)DNA文庫(kù)中篩選到能與 U87-EGFRvⅢ細(xì)胞特異結(jié)合的DNA適配子A15,其中篩選過(guò)程中引入負(fù)篩細(xì)胞 U87 (EGFRvⅢ表達(dá)陰性) 細(xì)胞作為對(duì)照,以去除細(xì)胞表面相同蛋白分子的干擾。相應(yīng)的DNA文庫(kù)序列為5'-GCAATGGTACGGTACTTCC(30N)CAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3'[5]。得到的 A15適配子通過(guò)不對(duì)稱 PCR法[6]用相應(yīng)的標(biāo)記引物擴(kuò)增并切膠回收,通過(guò)乙醇沉淀法得到DNA單鏈。

        1.2.2 A15特異識(shí)別U87-EGFRvⅢ細(xì)胞

        HEK293、SH-SY5Y、U87和U87-EGFRvⅢ細(xì)胞在 48孔板中培養(yǎng)過(guò)夜,用洗滌緩沖液(0.45%葡萄糖-5 mmol/L氯化鎂-PBS) 漂洗一次。將 200 pmol的 FITC標(biāo)記的 A15加入到500 μL結(jié)合緩沖液 (0.01% BSA-0.45%葡萄糖-5 mmol/L氯化鎂-PBS),95 ℃加熱 5 min,冰上放置10 min后加入培養(yǎng)板中。放置在5% CO2、37 ℃孵箱中孵育1 h,每隔5 min振搖一次。孵育完畢,用洗滌緩沖液洗滌3次,4%多聚甲醛固定15 min后用PBS洗滌3次,然后用1 mg/mL DAPI (1∶1 000) 染色10 min,在熒光顯微鏡下觀察 (40倍物鏡)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程避光操作。

        1.2.3 細(xì)胞酶聯(lián)反應(yīng)法 (cell-ELA) 檢測(cè)A15對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和力

        在 96孔板中接種密度為 1×105個(gè)/mL的U87-EGFRvⅢ細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后用0.1 mol/L PBS (pH 7.2~7.4) 漂洗一次,再用4%的多聚甲醛固定15 min。用1×PBST(0.01%的Tween-20) 洗板3次,5% BSA于37 ℃封閉2 h后棄封閉液,洗板3次。用PBS (加入0.01% 鮭魚(yú)精DNA) 對(duì)生物素標(biāo)記的初始DNA文庫(kù)、A15進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑯悠方K濃度分別為:2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 nmol/L,各樣品在95 ℃處理5 min,立刻置于冰上10 min后加入至U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的培養(yǎng)孔中37 ℃孵育1 h,1×PBST洗板3次。每孔加入 50 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素-PBS溶液 (1∶1 000),37 ℃孵育30 min后洗滌3次,每孔加入50 μL TMB顯色液,37 ℃避光顯色10 min。最后每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm的吸光度值。用SigmaPlot 12.0軟件處理數(shù)據(jù),擬合曲線方程Y=BmaxX/Kd+X,求出Kd值。用抗EGFR的抗體代替生物素標(biāo)記的A15加入至U87-EGFRvⅢ細(xì)胞中,用 5% BSA作為緩沖液倍比稀釋抗體,樣品終濃度為:4 ng/μL (27.59 nmol/L),2 ng/μL(13.79 nmol/L),1 ng/μL (6.90 nmol/L),0.5 ng/μL(3.45 nmol/L), 0.25 ng/μL (1.72 nmol/L),0.125 ng/μL (0.86 nmol/L) , 0.0625 ng/μL(0.43 nmol/L),0.03125 ng/μL (0.21 nmol/L),羊抗兔HRP標(biāo)記二抗1∶5 000稀釋?zhuān)瑱z測(cè)方法同上。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白 (不加一抗) 對(duì)照。陰性對(duì)照為生物素標(biāo)記的初始DNA文庫(kù)。

        1.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析

        用SigmaPlot 12.0軟件中非線性回歸分析作圖,求出曲線方程,比較方程中參數(shù)。

        2 結(jié)果

        2.1 生物素或FITC標(biāo)記的適配子A15的制備

        以A15的菌液為模板進(jìn)行不對(duì)稱PCR擴(kuò)增,其中上游引物帶有生物素標(biāo)記,擴(kuò)增的兩條鏈的比例為1∶4,擴(kuò)增較多的短鏈即為標(biāo)記上生物素或FITC的單鏈,大量切膠回收純化后,用7 mol/L尿素-8%聚丙烯酰胺變性膠電泳鑒定 (圖2)。結(jié)果表明通過(guò)不對(duì)稱PCR法獲得了生物素或FITC標(biāo)記的DNA適配子。

        2.2 A15特異識(shí)別U87-EGFRvⅢ細(xì)胞

        通過(guò)Western blotting實(shí)驗(yàn)用EGFR抗體對(duì)U87和 U87-EGFRvⅢ兩種細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示 U87細(xì)胞表達(dá) EGFR (170 kDa),而U87-EGFRvⅢ過(guò)表達(dá) EGFRvⅢ,它是 EGFR缺失了胞外區(qū)2~7個(gè)外顯子的的Ⅲ型突變體,條帶分子量為 145 kDa (圖 3)。FITC-A15分別與HEK293、SH-SY5Y、U87和U87-EGFRvⅢ細(xì)胞孵育,用熒光顯微鏡觀察結(jié)合特異性情況,結(jié)果見(jiàn)圖 4。未加 FITC-A15的細(xì)胞未觀察到熒光,即為細(xì)胞背景,加入了 FITC-A15后,在U87-EGFRvⅢ細(xì)胞上可觀察到綠色熒光,HEK293、SH-SY5Y和 U87細(xì)胞都觀察不到明顯的熒光,DAPI染色后,細(xì)胞核呈藍(lán)色。結(jié)果表明,A15能特異識(shí)別U87-EGFRvⅢ細(xì)胞。

        圖2 不對(duì)稱PCR切膠回收得到的biotin和FITC標(biāo)記的適配子A15Fig. 2 Biotinylated and FITC-labeled A15 aptamers were generated by asymmetrical PCR. 1: pUC18 DNA/Msp l; 2: biotin-A15; 3: FITC-A15.

        圖3 EGFR抗體鑒定U87和U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的免疫印跡實(shí)驗(yàn)Fig. 3 U87 and U87-EGFRvIII cells identified by Western blotting. 1: U87 cells expressing EGFR(170 kDa); 2: U87-EGFRvIII cells overexpressing EGFRvIII (145 kDa).

        圖 4 熒光顯微鏡檢測(cè)適配子 FITC-A15對(duì)U87-EGFRvⅢ的特異性結(jié)合 (40×)Fig. 4 Fluorescent microscope imaging of U87-EGFRvIII, U87, and HEK293 cells stained with FITC-A15. U87 and HEK293 cells served as negative controls (40×).

        2.3 Cell-ELA檢測(cè)初始DNA文庫(kù)、A15適配子和EGFR抗體三者對(duì)U87-EGFRvIII細(xì)胞的親和力

        用cell-ELA方法檢測(cè)生物素標(biāo)記的初始DNA文庫(kù)、A15和抗 EGFR的抗體對(duì) U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和力,測(cè)定450 nm時(shí)的吸光度值,在Sigmaplot 12.0軟件中進(jìn)行非線性回歸分析,擬合曲線見(jiàn)圖 5。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn) A15的 Kd值為(14.09±2.95) nmol/L (R=0.9653),小于 100 nmol/L,與以往報(bào)道過(guò)的 cell-SELEX篩選到的適配子親和力在pmol/L~nmol/L范圍內(nèi)相符。適配子A15的Kd值與抗體EGFR對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和力 (Kd=0.32±0.01 nmol/L,R=0.9989) 相比,A15的親和力已經(jīng)接近抗體的親和力。陰性對(duì)照初始DNA文庫(kù)的Kd值為 (726.28±200.75) nmol/L(R=0.9952),由此可見(jiàn),相比初始DNA文庫(kù)而言,A15和 EGFR抗體對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞有較高的親和力。

        圖5 Cell-ELA法測(cè)定初始DNA文庫(kù)、適配子A15或抗體EGFR對(duì)U87-EGFRvⅢ細(xì)胞的親和力Fig. 5 The binding affinity of the initial library,aptamer A15 and an anti-EGFR antibody for U87-EGFRvIII cells as measured by cell-ELA.

        3 討論

        目前在 cell-SELEX技術(shù)應(yīng)用中,測(cè)定適配子 Kd值的方法有流式細(xì)胞技術(shù)[8](Flow cytometry,F(xiàn)CM)、熒光定量分析[9](Fluorescence quantification analysis,F(xiàn)QA)、放射免疫法[10](Radioimmunoassay,RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等。其中ELISA試驗(yàn)用于cell-SELEX中適配子與靶分子親和力的測(cè)定具有如下優(yōu)點(diǎn):生物素標(biāo)記的適配子比熒光標(biāo)記的要穩(wěn)定;整個(gè) ELISA試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì);所用試劑成本低且無(wú)污染;測(cè)定的結(jié)果靈敏度高。ELISA在適配子的親和力的測(cè)定已經(jīng)有了很多應(yīng)用,早在 2004年已有研究小組建立了酶聯(lián)寡聚核苷酸吸附試驗(yàn)(Enzyme-1inked oligonucleotide assay,ELONA)方法用于hTNF-α的檢測(cè)[11]。CHO等[12]用ELISA方法來(lái)檢測(cè)針對(duì)SARS COV (冠狀病毒) N蛋白的DNA適配子是否富集及其親和力,得到適配子 1 (Kd=4.93±0.30 nmol/L) 和適配子 11(Kd=9.02±1.89 nmol/L)。Kazem 等[13]在 4 ℃條件下用 ELISA方法測(cè)定不同篩選輪數(shù) DNA 適配子對(duì)HER2高表達(dá)細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞的結(jié)合力,隨著篩選輪數(shù)的增加,吸收值也增加,表明適配子在富集。Zhu等[14]篩選針對(duì)MPT64抗體的DNA適配子,并嘗試用 ELISA方法來(lái)檢測(cè)臨床血清樣本,數(shù)據(jù)證明其最低檢測(cè)限為0.2 mg/L,是用于肺結(jié)核病人血清診斷的一種有效的方法。

        EGFRvⅢ是 EGFR胞外區(qū) 2~7個(gè)外顯子(EGFR?2-7) 缺失導(dǎo)致的突變體,與腫瘤的侵襲性和致瘤性有關(guān)[15-16]。EGFRvⅢ在正常細(xì)胞中不表達(dá)[17-21],在 25%的惡性膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)[22],因此篩選特異識(shí)別 EGFRvⅢ的適配子對(duì)探求診斷和治療惡性膠質(zhì)瘤的方法具有重大意義。

        本研究在 Friguet法[23]基礎(chǔ)上,通過(guò)以全細(xì)胞表面分子作為抗原,生物素標(biāo)記的適配子作為抗體,利用生物素-鏈親合素系統(tǒng)應(yīng)用于 ELISA試驗(yàn)[24]來(lái)測(cè)定適配子 A15與 U87-EGFRvⅢ的Kd值。結(jié)果顯示與抗體相比,適配子的親和力接近抗體的親和力。熒光顯微鏡觀察也證實(shí)適配子對(duì)靶細(xì)胞具有特異識(shí)別能力。目前熒光定量分析方法檢測(cè)適配子對(duì)靶細(xì)胞的親和力,標(biāo)記探針用的熒光染料有異硫氰酸熒光素 (FITC)、羥基熒光素 (FAM)、四氯熒光素 (TET) 等,但此類(lèi)熒光素類(lèi)衍生物有共同的缺點(diǎn):光淬滅率高、pH敏感性強(qiáng)和發(fā)射波譜寬等[25-27]。Cell-ELA法克服了熒光標(biāo)記方法進(jìn)行定量分析的缺點(diǎn),實(shí)現(xiàn)非熒光標(biāo)記定量檢測(cè)微量物質(zhì)的目的,解決了篩選中適配子親和力的定量分析問(wèn)題,為建立cell-SELEX篩選技術(shù)平臺(tái)提供了重要保證。但以細(xì)胞作為抗原進(jìn)行 cell-ELA有諸多的缺點(diǎn),比如:空白值與單純的純化蛋白相比要高;由于細(xì)胞的貼壁特性,不能使用雙抗夾心法[11]等更加靈敏的 ELISA方法用來(lái)測(cè)定適配子與靶分子的親和力。

        Cell-ELA可以代替熒光標(biāo)記法進(jìn)行定量分析,進(jìn)一步證明了ELISA在cell-SELEX中測(cè)定適配子親和力的應(yīng)用可行性;適配子和單克隆抗體一樣,可以作為檢測(cè)分子用于診斷某些疾病。

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        November 13, 2012; Accepted: February 1, 2013

        Xingmei Zhang. Tel: +86-20-61648215; E-mail: zhangxm@smu.edu.cn

        Cell-ELA-based determination of binding affinity of DNA aptamer against U87-EGFRvIII cell

        Yan Tan1, Huiyu Liang1, Xidong Wu1, Yubo Gao2, and Xingmei Zhang1
        1Department of Neurobiology,School of Basic Medical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou510515,Guangdong,China
        2First Clinical Medicine College,Southern Medical University,Guangzhou510515,Guangdong,China

        A15, a DNA aptamer with binding specificity for U87 glioma cells stably overexpressing the epidermal growth factor receptor variant III (U87-EGFRvIII), was generated by cell systematic evolution of ligands by exponential enrichment (cell-SELEX) using a random nucleotide library. Subsequently, we established a cell enzyme-linked assay(cell-ELA) to detect the affinity of A15 compared to an EGFR antibody. We used A15 as a detection probe and cultured U87-EGFRvIII cells as targets. Our data indicate that the equilibrium dissociation constants (Kd) for A15 were below 100 nmol/L and had similar affinity compared to an EGFR antibody for U87-EGFRvIII. We demonstrated that the cell-ELA was a useful method to determine the equilibrium dissociation constants (Kd) of aptamers generated by cell-SELEX.

        cell enzyme-linked assay (cell-ELA), cell based systematic evolution of ligands by exponential enrichment(cell-SELEX), DNA aptamer, Kd

        book=670,ebook=397

        Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 81272509, 30973481).

        國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81272509,30973481) 資助。

        (本文責(zé)編 郝麗芳)

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