黃海進，何秀芝，焦峰

(中國人民解放軍第82醫(yī)院，江蘇淮安 223001)

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國，胃癌發(fā)病率位于惡性腫瘤的第2位，死亡率位于第3位［1］，并且現(xiàn)在胃癌發(fā)病年齡逐漸年輕化，對人們的健康產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。胃癌有效的治療方法仍以外科手術(shù)為主，目前我國就診的胃癌患者中大多屬于中晚期，手術(shù)切除率僅為50%左右，術(shù)后5年生存率僅有20%～30%［2］，故術(shù)后化療顯得尤為重要。因胃癌發(fā)生、發(fā)展與飲食因素關(guān)系密切，所以尋找天然植物治療胃癌具有重要的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。目前，臨床上用于治療腫瘤的植物藥已篩選出20余種，包括生物堿、木脂素、柄型大環(huán)化合物、二萜類化合物等，其中紫杉醇、長春新堿等藥物已經(jīng)在臨床上大量使用。高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)是從粗榧屬植物中提取的一種生物堿，是我國自主研制成功的高效抗腫瘤藥物，目前臨床主要用于急性髓系白血病、慢性粒細(xì)胞白血病和骨髓增生異常綜合征的治療［3-4］。之前的研究顯示，HHT治療腫瘤的主要機制是抑制腫瘤DNA及蛋白質(zhì)合成、抑制腫瘤細(xì)胞與纖維蛋白原的結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［5］。HHT抗胃癌作用的研究尚未見報道，本實驗觀察HHT對體外培養(yǎng)的人SGC-7901胃癌細(xì)胞株的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，以探求治療胃癌的新藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SGC-7901細(xì)胞由上海腫瘤研究所提供，RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibeo公司，胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自北京華邁科生物技術(shù)公司，乙二胺四乙酸(EDTA)購自上海永葉生物科技公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Amresco公司，培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿均購自德國Corning公司，Annexin V·FITC/PI試劑盒購自上海晶美生物公司;CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司，酶標(biāo)測定儀購自南京萊步科技公司，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液1次，7～10 d后用2.5 g·L－1的胰蛋白酶消化傳代1次。據(jù)HHT濃度分為空白對照組和HHT小、中、大劑量組(劑量依次為 20、80、120 μg·ml－1)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實驗 將培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞用胰蛋白酶加EDTA消化并稀釋成(4.0～5.0)×104ml－1的活細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，設(shè)8個復(fù)孔，于24 h后補充新鮮培養(yǎng)基80 μl并加入不同濃度的藥物20 μl，使HHT終濃度分別為20、80、120 μg·ml－1，空白對照組加入20 μl完全培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至預(yù)定時間，吸棄舊培養(yǎng)液，加入5 mg·ml－1的MTT 15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄全部上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩后于酶標(biāo)儀波長490 nm處測定用藥后24、48、72 h各孔光密度(OD)值，實驗重復(fù)3次，按下列公式計算細(xì)胞生長抑制率:抑制率(%)=

1.2.3 細(xì)胞周期及凋亡率分析 以上終濃度的HHT分別作用SGC-7901細(xì)胞24 h后，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞。離心棄上清，用0.1 mol·L－1、pH 7.4的PBS洗滌3次。將細(xì)胞沉淀充分混勻，用預(yù)冷的75%乙醇固定，4℃過夜。PBS洗脫乙醇后加入10 μl RNA酶和10 μl PI，4℃避光染色。30 min后用FACScalibur流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化，ModFit LT V 3.0軟件分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖抑制實驗結(jié)果

HHT 在 20、80、120 μg·mL－1濃度下與空白對照組比較，作用24、48、72 h均能呈現(xiàn)一定的劑量和時間依賴關(guān)系，見表1和圖1。

表1 不同濃度HHT作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞不同時間平均OD值比較± s，n=3)

表1 不同濃度HHT作用人胃癌SGC-7901細(xì)胞不同時間平均OD值比較± s，n=3)

HHT/μg·ml－1 平均 OD值24 h 48 h 72 h 0 0.354±0.003 0.763±0.013 0.969±0.009 20 0.321±0.007 0.671±0.010 0.700±0.010 80 0.288±0.010 0.574±0.013 0.571±0.011 120 0.247±0.006 0.494±0.088 0.401±0.014

2.2 HHT對SGC-7901細(xì)胞周期的影響

不同濃度的HHT分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞比例無明顯變化(P＞0.05)，G2/M期細(xì)胞比例呈藥物劑量依賴性增加，不同濃度HHT組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，表2、圖2)，S期細(xì)胞比例逐漸降低(P＜0.05)，表明存在 G2/M期阻滯。

圖1 不同濃度HHT作用不同時間后SGC-7901細(xì)胞生長抑制率的變化

表2 不同濃度HHT分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后不同細(xì)胞周期比例± s，n=3)

表2 不同濃度HHT分別作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后不同細(xì)胞周期比例± s，n=3)

注:不同濃度HHT組S期與G2/M期細(xì)胞百分率之間比較，P＜0.05

HHT/μg·ml－1 細(xì)胞周期比例/%G0/G1 S G2/M 0 46.9±0.89 52.04±0.33 1.06±0.72 20 46.57±0.88 49.19±0.76 4.24±1.61 80 44.28±0.41 42.36±0.58 13.36±0.98 120 47.03±0.35 31.27±0.32 21.7±0.66

圖2 不同濃度HHT作用SGC-7901細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期及凋亡流式細(xì)胞圖

3 討 論

目前對胃癌的治療手段中化學(xué)治療處于極其重要的地位。但大多數(shù)藥物使用后病人會有一定的不良反應(yīng)，因此尋找安全有效的抗腫瘤治療藥物是一個迫切需要解決的問題［6］。

HHT來源豐富，可通過三尖杉屬植物的莖、葉、根、果皮經(jīng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)或組織培養(yǎng)和次級培養(yǎng)，也可以從含有HHT的植物材料或培養(yǎng)細(xì)胞或植物組織經(jīng)溶媒提取、分離、精制得到，還可以從提取過的三尖杉屬植物的殘渣中經(jīng)半合成方法獲得［7］。

HHT能抑制真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，使多聚核糖體解聚，干擾蛋白核體糖功能，對細(xì)胞內(nèi)DNA的合成亦有抑制作用［8-9］。研究顯示HHT對多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，尤其用于急性淋巴細(xì)胞或慢性粒細(xì)胞白血病有較好的療效［10-11］。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動的基本過程，如果細(xì)胞周期某一時相出現(xiàn)異常，細(xì)胞將進入病理過程。藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用與干擾細(xì)胞增殖周期、抑制細(xì)胞周期間的正常轉(zhuǎn)化、促進細(xì)胞向凋亡通路發(fā)展有關(guān)。我們采用流式細(xì)胞儀分析HHT作用后SGC-7901胃癌細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示HHT能夠誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)劑量依賴性的G2/M期阻滯。細(xì)胞凋亡圖上呈現(xiàn)出隨藥物濃度增加而逐步增高的凋亡峰。HHT通過將SGC-7901胃癌細(xì)胞阻滯于G2/M期，干擾細(xì)胞各生長周期間的正常轉(zhuǎn)化，從而以劑量依賴性方式增加亞“G1”期凋亡峰，減慢細(xì)胞周期進程、抑制細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果進一步證實HHT對SGC-7901胃癌細(xì)胞的生長抑制作用是通過促進細(xì)胞凋亡完成的。

本實驗證明，HHT在體外可抑制人SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖，其抑制率隨著劑量的增加而升高，且HHT在一定劑量下能誘導(dǎo)人SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡，但其具體機制尚待進一步研究。

［1］徐飚，王建明.胃癌流行病學(xué)研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2006(1):81-87.

［2］ KATIYAR S K，MUKHTAR H.Tea in chemoprevention of cancer;epi-demiologic amd experimental studies［J］.Intl J Oncol，1996，8:221-238.

［3］張艷艷，韓婷，吳令上，等.三尖杉堿類化合物的來源、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2011(5):370-374.

［4］李玉峰，丁幫和，朱家斌，等.伊馬替尼聯(lián)合高三尖杉酯堿治療初診慢性髓細(xì)胞性白血病療效觀察［J］.東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2009，28(5):430-432.

［5］LI Y F，LIU X，LIU D S.The effect of homoharringtonine in patients with chronic myeloid leukemia who have failed or responded suboptimally to imatinib therapy［J］.Leuk Lymphoma，2009，50(11):1889-1891.

［6］HA T K，JUNG M S，LEE K H.The effect of adjuvant chemotherapy on stageⅣ(T4N1-3M0 and T1-3N3M0)gastric cancer［J］.Cancer Res Treat，2009，41(1):19-23.

［7］何洪源.中國粗榧果實和枝葉中三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿分離方法的研究［J］.中草藥，2001(3):11-2.

［8］XU W L，JIN J，QIAN W B.Homoharringtonine in combination with cytarabine and aclarubicin as induction therapy improves remission and survival of patients with higher risk myelodysplastic syndromes［J］.Chin Med J，2010，123(1):108-110.

［9］GU L F，ZHANG W G，WANG F X，et al.Low dose of homoharringtonine and cytarabine combined with granulocyte colony-stimulating factor priming on the outcome of relapsed or refractory acute myeloid leukemia［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2011，137(6):997-1003.

［10］JIN Y，LU Z，CAO K，et al.The antitumor activity of homoharringtonine against human mast cells harboring the KIT D816V mutation［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(1):21-23.

［11］CHEN R，GUO L，CHEN Y，et al.Homoharringtonine reduced Mcl-1 expression and induced apoptosis in chronic lymphocytic leukemia［J］.Blood，2011，117(1):156-64.