盧穎輝，何杰，田小強(qiáng)，常立功，黃培林

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009;2.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 病理科，安徽合肥 230000)

由于單個(gè)標(biāo)志物往往不能準(zhǔn)確診斷某種腫瘤，所以研發(fā)新型具有高通量聯(lián)合檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物的方法就顯得格外重要。目前常用的傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法常只能檢測(cè)單個(gè)腫瘤標(biāo)志物，在需檢測(cè)多個(gè)標(biāo)志物時(shí)會(huì)造成資源浪費(fèi)［1-2］。相對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，多元檢測(cè)技術(shù)具有高通量、高靈敏度、節(jié)省待測(cè)樣本、縮短檢測(cè)時(shí)間、降低檢測(cè)成本等優(yōu)勢(shì)［3］。

本研究采用基于膠體晶體微球編碼載體的多元檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。這種微列陣的載體是二氧化硅膠體晶體微球(silica crystal colloidal spheres，SCCBs)。這些載體的編碼是源于它們結(jié)構(gòu)周期性的特有的反射峰，所以不會(huì)有諸如褪色、漂白、粹滅以及化學(xué)不穩(wěn)定等問(wèn)題［4-5］。另外，由于沒(méi)有染色和與熒光相關(guān)的物質(zhì)存在，所以SCCBs的背景很低［6-7］。在本研究中，我們?cè)诔晒?gòu)建SCCBs微列陣的基礎(chǔ)上，應(yīng)用雙抗夾心法對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)ELISA方法進(jìn)行比對(duì)，初步探討基于SCCBs的微列陣多元檢測(cè)技術(shù)的可行性、高通量及其高靈敏度等特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG-44由蘇州大學(xué)提供，DMEM高糖培養(yǎng)基在細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人p21抗體、異硫氰酸熒光素(FITC標(biāo)記)標(biāo)記的二抗均購(gòu)自BD公司，牛血清蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司，5%的PBS緩沖液(pH 7.4)、SCCBs由東南大學(xué)生物電子國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，細(xì)胞裂解液以及CBA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，人Bcl-2、p21蛋白ELISA試劑盒均購(gòu)自南京迪堯生物技術(shù)公司。

1.1.3 主要儀器 金相顯微鏡(OLYMPUS BX51)、熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71)、高靈敏度彩色CCD攝像頭(Evolution MP 5.0)、高靈敏度冷CCD(DP30)、光纖光譜儀(USB2000-FLG，QE65000)、細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建SCCBs懸浮微列陣 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸出最合適的時(shí)間和溫度，標(biāo)記上探針，構(gòu)建最佳狀態(tài)的懸浮微列陣。探針?lè)肿邮峭ㄟ^(guò)共價(jià)結(jié)合固定在SCCBs表面的。首先，SCCBs作親水處理，在濃硫酸與雙氧水7∶3的溶液中浸泡48 h，用純水洗干凈，烘干后用10%的G-PTMS甲醛溶液浸泡過(guò)夜，分別用甲醛和乙醇溶液洗，然后用純水洗干凈。SCCBs標(biāo)探針。本研究用的10 μl體系每管都是10 μl、5 個(gè)微球。將10 μl的一抗加到EP管里，4℃過(guò)夜。

1.2.2 免疫檢測(cè) 應(yīng)用雙抗夾心法，首先用不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線;再用同一條件的微列陣定量檢測(cè)從人膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取的總蛋白中的Bcl-2、p21蛋白。檢測(cè)在同一試管中進(jìn)行。

將孵育過(guò)夜的微球用PBS緩沖液洗3～4遍，每次5 min;加5%的BSA蛋白溶液封閉2 h，條件是37℃振蕩搖勻;封閉過(guò)后的微球要用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min;再加待測(cè)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或者細(xì)胞蛋白樣品孵育30 min，37℃振蕩搖勻;標(biāo)準(zhǔn)品的配制與樣品的稀釋都用PBS緩沖液;然后用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min;洗完后孵育 FITC標(biāo)記的二抗30 min，37℃振蕩搖勻;孵育過(guò)后用PBS緩沖液洗4～5遍，每次5 min。在熒光顯微鏡下觀察并記錄熒光。

在進(jìn)行多元腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)時(shí)，不同編碼的SCCBs表面固定各自的探針?lè)肿?，并被混合在一起置于同一試管?nèi)。

ELISA檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別檢測(cè)蛋白提取物中的Bcl-2、p21蛋白，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基于SCCBs的懸浮列陣的構(gòu)建

如圖1所示，5種光子 SCCBs的反射峰分別是447、510、562、592 和 617 nm，我們從 5 種微球中選出兩種反射峰居中而又有一定差別的微球(微球反射峰分別是510、592 nm)用于下一步研究。

圖1 5種微球的光譜圖Fig 1 Reflection spectra of the five kinds of SCCBs

2.2 用懸浮微列陣方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

用懸浮微列陣方法檢測(cè)得到Bcl-2和p21的線性范圍分別是9 ～180 ng·ml－1和0.05 ～1 ng·ml－1。

圖2、3為Bcl-2、p21蛋白的濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。跟傳統(tǒng)的免疫分析結(jié)果一致，呈現(xiàn)非線性，將其進(jìn)行曲線擬合處理。結(jié)果分析顯示，以上兩種腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)下限(信噪比為3σ)分別為1 ng和0.049 ng?；赟CCBs載體的多元檢測(cè)方法在腫瘤分析中的靈敏度以及檢測(cè)范圍適合臨床應(yīng)用。

圖2 Bcl-2的濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系曲線圖Fig 2 Calibration plots of fluorescence intensity vs Bcl-2 tumor marker concentrations

圖3 p21的濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系曲線圖Fig 3 Calibration plots of fluorescence intensity vs p21 tumor marker concentrations

2.3 樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)30份細(xì)胞總蛋白樣本進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)每個(gè)標(biāo)記物檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，得到如圖4所示的分析結(jié)果關(guān)系圖。由圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，基于SCCBs編碼載體所獲得的腫瘤標(biāo)記物檢測(cè)結(jié)果和商業(yè)化方法獲取的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。結(jié)果如下所示(x列:ELISA;y列:光子懸浮列陣):

p21:y=0.928 1x+0.110 7(R2=0.988 9)

Bcl-2:y=0.951 7x+5.403(R2=0.988 6)

圖4 基于SCCBs載體技術(shù)和ELISA樣本檢測(cè)結(jié)果 橫坐標(biāo)為ELISA檢測(cè)結(jié)果，縱坐標(biāo)為光子懸浮陣列技術(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig 4 Correlation between the photonic suspension array and the standard ELISA method for the two tumor marker

這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了我們開(kāi)發(fā)的多元檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法一樣具有較好的分析可靠性。另外，基于SCCBs編碼載體的檢測(cè)方法消耗更少的樣品量，并可以在同一試管內(nèi)完成兩種腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)，極大地簡(jiǎn)化了免疫檢測(cè)過(guò)程。

3 討 論

腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)在癌癥的早期篩查、正確分型、治療評(píng)估及預(yù)后、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)等方面具有重要意義，特別是多種腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)臨床腫瘤的準(zhǔn)確診斷至關(guān)重要［8-10］。目前常用的有效的檢測(cè)方法只能分別檢測(cè)某一種腫瘤標(biāo)記物，常無(wú)法準(zhǔn)確反映疾病的本質(zhì)，臨床應(yīng)用價(jià)值有待進(jìn)一步探討。目前所采用的多元檢測(cè)的方法各式各樣，但是大多都是基于生物分子的固定和識(shí)別。為了同時(shí)區(qū)分不同的檢測(cè)事件，生物分子必須被編碼。但是生物探針?lè)肿拥倪@種編碼其位置或者坐標(biāo)必須是固定的，靶分子要到達(dá)探針?lè)肿游恢貌⑴c之反應(yīng)，這一過(guò)程受擴(kuò)散速度的限制，因此這會(huì)影響靶分子和探針?lè)肿拥姆磻?yīng)速度，令檢測(cè)所需時(shí)間延長(zhǎng)［11-12］。

近年來(lái)，將探針?lè)肿庸潭ㄔ谖⑶虮砻娴奈⒘嘘嚰夹g(shù)為多元檢測(cè)提供了巨大的技術(shù)支撐［13-14］。在本研究中，利用基于SCCBs編碼載體的多元檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物，我們首先優(yōu)化了腫瘤標(biāo)記物探針?lè)肿釉赟CCBs表面的固定條件及微球表面探針與標(biāo)記物反應(yīng)的條件，提高了檢測(cè)靈敏度。我們研究了物理吸附的方法和化學(xué)偶聯(lián)的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCCBs高溫處理后其親水效果明顯，可以被水完全浸潤(rùn)，這就導(dǎo)致了以疏水作用為主的探針?lè)肿釉谖⑶虮砻嫖锢砦降男实拖?。另外，探針?lè)肿釉谖⑶虮砻嫖降淖儺愊禂?shù)也較高，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性。相比而言，以化學(xué)偶聯(lián)法在微球表面固定探針?lè)肿泳哂懈叩姆€(wěn)定性及固定效率。從微球大小和反應(yīng)時(shí)間等方面進(jìn)行優(yōu)化，我們發(fā)現(xiàn)，微球的熒光強(qiáng)度在孵育了30 min之后達(dá)到飽和。在反應(yīng)時(shí)間方面，這種微列陣的雙抗夾心免疫孵育時(shí)間比傳統(tǒng)ELISA方法的1～3 h短很多，這是因?yàn)镾CCBs有很高的比表面積，使免疫反應(yīng)速度大大提高。在檢測(cè)所需要樣品的量方面，由于基于SCCBs的微列陣是在一個(gè)試管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種微球，所以每管檢測(cè)樣品只需加10 μl，而ELISA方法只能1個(gè)孔測(cè)1種蛋白，所以要測(cè)兩種蛋白就要用20 μl的樣品。如果待測(cè)物再增多的話，基于SCCBs微列陣方法就會(huì)節(jié)省非常可觀的待測(cè)樣品。在檢測(cè)高通量方面，傳統(tǒng)的ELISA方法是單一檢測(cè)的，而本研究中的新方法有報(bào)道稱可以同時(shí)檢測(cè)上百種待測(cè)樣品。由于此技術(shù)是在1個(gè)試管內(nèi)檢測(cè)多種標(biāo)記物，使其檢測(cè)過(guò)程大大簡(jiǎn)化，效率大大提高。

基于SCCBs的多元檢測(cè)技術(shù)與傳統(tǒng)的ELISA方法分別對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞蛋白提取物中Bcl-2蛋白、p21蛋白的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，顯示兩種方法檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。此外，較之ELISA法，基于SCCBs的多元檢測(cè)方法可明顯降低樣品量，并可以在同一反應(yīng)體系內(nèi)完成多種腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)，極大地簡(jiǎn)化了免疫檢測(cè)過(guò)程。由此可見(jiàn)，基于SCCBs編碼載體的多元檢測(cè)技術(shù)在基因研究、藥物篩選、臨床診斷等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。在本研究中，一種新型的多元檢測(cè)方法被應(yīng)用于腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)，這種方法就是懸浮微列陣。SCCBs作為這種微列陣的載體，其表面是納米粒子，這樣可以大大減小空間位阻，提高反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。因此，光子懸浮陣列特別適合檢測(cè)疾病診斷標(biāo)記物，值得進(jìn)一步完善和探索。

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