張 建 吳志剛 趙 鑫 馬 銘 寧 偉 *

（1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2農(nóng)業(yè)部東北野菜種質(zhì)異位保存 圃 與鑒定中心，遼寧沈陽 110866）

我國有蒲公英屬植物70種，1變種，其中東北地區(qū)分布蒲公英11種。蒲公英已被我國《藥典》（2010年版）和《獸藥典》（2010年版）收錄為大宗藥材，同時(shí)被國家衛(wèi)生部列為藥食同源食品，廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)中藥以及飼料添加劑原料（張波 等，2011）。目前國內(nèi)外對蒲公英的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性、組織培養(yǎng)、加工技術(shù)等方面（陳華和李銀心，2004）。蒲公英屬植物存在無融合生殖、有性生殖和兼性生殖等生殖方式（黃群策，2000；胡適宜，2005），這是研究生殖類型非常寶貴的資源，但目前對其生殖特性未進(jìn)行研究報(bào)道與詳細(xì)闡述。Whitton等（2008）通過授粉套袋試驗(yàn)對歐洲蒲公英屬植物繁育系統(tǒng)進(jìn)行研究，初步得出二倍體蒲公英為有性生殖，多數(shù)三倍體蒲公英為專性無融合生殖，少數(shù)三倍體以及四倍體蒲公英為兼性無融合生殖的結(jié)論，但并未對無融合的生殖類型以及胚和胚乳倍性之比做進(jìn)一步分析。本試驗(yàn)以東北地區(qū)廣泛分布的朝鮮蒲公英為試材，通過染色體計(jì)數(shù)、人工授粉試驗(yàn)以及流式細(xì)胞儀檢測等試驗(yàn)方法，確定其生殖類型，同時(shí)為蒲公英生殖遺傳規(guī)律以及分子機(jī)制研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材于2008年5～8月采于遼寧東部山區(qū)，經(jīng)中國科學(xué)院沈陽生態(tài)研究所李冀云研究員鑒定為朝鮮蒲公英，栽種于東北野菜種質(zhì)資源異位保存圃生態(tài)試驗(yàn)區(qū)，常規(guī)生態(tài)模式管理。2012年5月植株進(jìn)入花期時(shí)進(jìn)行各種觀察測定。

1.2 套袋、去雄及人工授粉試驗(yàn)

2012年5月，朝鮮蒲公英處于盛花期，選擇生長勢良好的20株植株，每植株隨機(jī)選取未開放的3朵花，將60朵花分成6組（每組10朵），以自然條件下朝鮮蒲公英花序?yàn)閷φ?，分別設(shè)5個(gè)處理：①不去雄套袋；②去雄套袋；③人工自交授粉套袋；④人工異交授粉套袋；⑤去雄去柱頭。為防止花葶倒伏，用木棍對花葶進(jìn)行固定，待種子成熟后，統(tǒng)計(jì)結(jié)籽率。

1.3 染色體數(shù)目觀察

采用常規(guī)壓片法進(jìn)行根尖染色體觀察（寧偉 等，2012）。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測

以整個(gè)果序成熟種子（100粒左右）為材料，取植株2 g嫩葉為對照，在Chopping Buffer緩沖液（1.5 mL）中剪碎，經(jīng)300目篩網(wǎng)過濾，1 000 r·min-1離心10 min，棄上清，余下DNA加PI染色（一個(gè)樣加1 mL），搖勻，避光15 min，然后經(jīng)500目篩網(wǎng)過濾，搖勻，上機(jī)檢測。每次測定20 000個(gè)細(xì)胞。檢測結(jié)束后在流式細(xì)胞儀上得到各峰值相對倍性。

2 結(jié)果與分析

2.1 套袋、去雄及人工授粉試驗(yàn)

由表1可見，自然條件下的結(jié)籽率為97.66%，除了人工異交授粉+套袋處理的結(jié)籽率較高，為86.56%外，其他處理結(jié)籽率均在50%左右。表明朝鮮蒲公英具有兼性無融合生殖現(xiàn)象，其無融合生殖發(fā)生率大約在50%左右，其生殖方式屬于無融合+專性異交類型。

2.2 染色體計(jì)數(shù)觀察

通過根尖細(xì)胞染色體觀察，確定朝鮮蒲公英染色體數(shù)目為32（圖1）。蒲公英屬植物染色體組基數(shù)為8，所以朝鮮蒲公英為四倍體。

表1 蒲公英不同授粉處理下的結(jié)籽率

2.3 朝鮮蒲公英后代檢測

胚囊類型、胚乳發(fā)育受精與否對胚乳細(xì)胞倍性水平影響較大（Urbani et al.，2002）。朝鮮蒲公英種子檢測出3個(gè)峰（圖2）。第一個(gè)峰值400，第二個(gè)峰值為590，第三個(gè)峰值為770，三者相比為1∶1.475∶1.925，3種倍性水平之比接近2C∶3C∶4C。二倍體峰反映的是胚的倍性情況，三倍體峰和四倍體峰表示胚乳細(xì)胞具有不同倍性水平。說明種子的胚和胚乳形成存在有性生殖情況，因此種子細(xì)胞中檢測到3種倍性峰。結(jié)果表明朝鮮蒲公英屬于兼性無融合生殖，且胚乳為自主發(fā)育。

圖1 朝鮮蒲公英根尖染色體數(shù)目

圖2 朝鮮蒲公英葉片以及種子DNA含量分布

3 結(jié)論與討論

朝鮮蒲公英去雄套袋結(jié)籽率為48.79%，表明其具有無融合生殖現(xiàn)象。植物無融合生殖特性與其倍性有特殊關(guān)系（劉傳虎 等，2007）。本試驗(yàn)染色體觀察表明朝鮮蒲公英為四倍體，與少數(shù)三倍體以及四倍體蒲公英為兼性無融合生殖的結(jié)論一致（Whitton et al.，2008），流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明朝鮮蒲公英為兼性無融合生殖類型，這與兼性無融合生殖植物山柳菊種子檢測結(jié)果一致（Matzk et al.，2000）。 本試驗(yàn)為蒲公英無融合生殖胚乳自主發(fā)育提供了直接證據(jù)。

兼性無融合，就是有兩套生殖系統(tǒng)，除了真正的無融合后代，還有非母本的后代（Crane，2001）。這種兼性無融合生殖方式對于入侵新的生境條件是非常有益的（Wilson et al.，2006）。在兼性無融合中，有性和無融合胚囊發(fā)育時(shí)間是不同的，授粉時(shí)間對于決定有性/無融合的比例具有重要作用（Bicknell & Koltunow，2004；Krahulcová et al.，2004）。環(huán)境以及花粉量對無融合的發(fā)生率可能也有一定影響，這還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)進(jìn)行論證。

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