邵 勤 于澤源 李興國 李 為 高艷娟

（東北農業(yè)大學園藝學院，黑龍江哈爾濱150030）

葉色變異是植物界的生命現(xiàn)象之一，其發(fā)生頻率相對較高，是比較常見的突變性狀。葉色突變體類型豐富，來源廣泛，形成的原因各不相同。它們是研究植物光合系統(tǒng)、抗病機制及激素生理等代謝過程的重要材料（Singh et al.，2000；Agrawal et al.，2001；Fambrini et al.，2004），同時也是分析鑒定基因功能和創(chuàng)造優(yōu)異種質資源的理想材料。近年來，國內外已從擬南芥（Jarvis et al.，1998）、水稻（Wu et al.，2007）、玉米（Yukari & Toshiya，2004）、大麥（Yaronskaya et al.，2003）、小麥（Koval et al.，2001）、油菜（Zhao et al.，2001）、黃瓜（苗晗 等，2010）等作物中發(fā)現(xiàn)、獲得并鑒定出一些葉色突變體。以往對于甜瓜（Cucumis meloL.）葉色突變體的研究報道主要著重于葉色突變體的發(fā)生和遺傳規(guī)律等方面（Whitaker，1952），但葉色變異的機理尚未明確，沒有對光合系統(tǒng)的超微結構、葉綠素代謝變化等葉片內部生理生化變化進行深入研究。

本試驗以新發(fā)現(xiàn)的甜瓜葉色黃化突變體9388-1為試材，通過對突變體與其突變親本白莎蜜1號葉綠體超微結構、光合色素含量、葉綠素的生物合成、葉綠素熒光參數(shù)等方面的比較，對葉色黃化突變體的生理生化變化進行研究，初步明確突變體葉色黃化的生理機制，為該性狀用于今后的育種實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料正常株系為白莎蜜1號（農家品種），不含葉色突變基因。突變體9388-1是在田間種植白莎蜜1號時發(fā)現(xiàn)的自然突變體，經過多年自交發(fā)現(xiàn)其后代葉色性狀不發(fā)生分離，能夠穩(wěn)定遺傳，在表型上與以往報道的甜瓜葉色突變體不同，整個生長周期都表現(xiàn)出該性狀。突變體9388-1除了葉色與白莎蜜1號有差異外，其他性狀并無較大差異。由于突變體9388-1葉片的黃化，影響其光合作用，植株生長比突變親本稍緩慢，但是其他農藝性狀均不受影響，生長發(fā)育正常（圖1）。

2012年3月13日將白莎蜜1號及其突變體9388-1播種育苗，4月26日定植于東北農業(yè)大學園藝試驗站塑料大棚中。試驗設突變親本和突變體兩個處理，每處理20株，3次重復，隨機區(qū)組排列，株距30 cm，行距60 cm，兩側各種保護行，常規(guī)田間管理。

1.2 方法

1.2.1 光合色素含量的測定 葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Caro）含量按照李合生（2000）的方法并略作修改，用T6紫外分光光度計進行測定，含量以mg·g-1（FW）表示。具體步驟如下：

① 5月15日植株處于伸蔓期，各處理隨機選10株，8：00～9：00取植株頂部向下數(shù)第5片葉，洗凈，用直徑0.5 cm的打孔器取50個圓片。

圖1 突變體與突變親本葉片顏色

② 隨機稱取葉片圓片0.2 g，共3份，分別裝入25 mL帶塞的刻度試管中，加入10 mL 80%的丙酮，浸提48 h，至組織發(fā)白。

③ 離心去上清液，用80%的丙酮定容至25 mL，以80%的丙酮為空白對照，溶液在波長為663、646 nm和470 nm下進行比色，所測得的吸光度（OD）代入以下公式計算出溶液中的Chla、Chlb 和 Caro 含量（mg·L-1）：

式中C表示葉綠素濃度。

1.2.2 葉綠素生物合成前體物質相對含量的測定 利用北京普析通用T6紫外分光光度計和日立850型熒光分光光度計測定葉綠素生物合成前體物質相對含量，參照徐培洲等（2006）的方法，略有改動。取處于伸蔓期（5月15日）的突變體和突變親本植株頂部向下數(shù)第5片葉進行測定。將白莎蜜1號的各種前體物質含量定為100%，與突變體9388-1進行比較。

① 5-氨基乙酰丙酸（ALA）的測定。將0.5 g葉片，用5 mL 4%的三氯乙酸（W/V）及少量石英砂研磨3遍并合并上清液，定容至20 mL，18 000g離心10 min，取上清液5 mL加入2.4 mL的醋酸鈉（1 mol·L-1）和0.15 mL的乙酰丙酮，沸水浴煮10 min后冷卻至室溫，取2 mL加入等體積的顯色液（Ehrlich-Hg試劑：1 g P-二甲胺基苯甲醛溶解于30 mL冰乙酸中，加入8 mL 70%的高氯酸，再用冰乙酸稀釋到50 mL，最后加入0.2 g升汞）黑暗條件下靜置15 min，后用紫外分光光度計測定553 nm處的OD值。

② 膽色素原（PBG）的測定。將0.5 g葉片用液氮研磨后，加入5 mL提取緩沖液（0.6 mol·L-1Tris，0.1 mol·L-1EDTA，pH 8.2），18 000g離心10 min，取上清液2 mL加入等體積的顯色液黑暗條件下靜置15 min后用紫外分光光度計測定553 nm處的OD值。PBG含量以553 nm的摩爾消光系數(shù)7.2×104mol-1·cm-1計算。

③ 尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）和糞卟啉Ⅲ（CoprogenⅢ）的測定。1 g葉片用液氮研磨后，加入10 mL的提取緩沖液（0.067 mol·L-1PBS，pH 6.8），18 000g離心10 min，取上清液5 mL加入0.25 mL 1%的硫代硫酸鈉，漩渦振蕩，用強光照射20 min。加入1 mol·L-1的冰乙酸調整pH至3.5。用10 mL乙醚進行萃取，重復3次，靜置分層后測定水相在405.5 nm處的OD值，UrogenⅢ含量以405.5 nm的摩爾消光系數(shù)5.48×105mol-1·cm-1計算；上述乙醚萃取液進行合并，再用3 mL 0.1 mol·L-1鹽酸萃取3次，合并后測定鹽酸相在395.5 nm處的OD值。CoprogenⅢ含量以405.5 nm的摩爾消光系數(shù)4.89×105mol-1·cm-1計算。

④ 原卟啉Ⅸ（ProtoⅨ）、鎂原卟啉（Mg-Proto）和原脫植基葉綠素酸酯（Pchlide）的測定。取葉片1 g進行冰浴研磨，溶于20 mL丙酮-0.1 mol·L-1氨水（9V：1V）溶液中，用等體積的正己烷萃取該丙酮溶液，靜置10 min，測定下層丙酮相的熒光發(fā)射強度E400F633、E400F622、E440F595和E440F640。根據(jù)以下公式即可計算ProtoⅨ和Pchlide的含量。

同時，鎂原卟啉（Mg-Proto）相對含量直接以E440F595值表示。

1.2.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定 采用美國LI-6400型便攜式光合儀，室外自然條件下，于上午直射光照射葉片前進行測定。隨機選取處于伸蔓期（5月15日）的突變體9388-1和白莎蜜1號植株頂部向下數(shù)第5片功能葉片進行測定，每個處理測10株，每株2次重復，取均值。測定前，葉片用錫泊紙包裹，進行暗適應30 min（全部做標記）后，按照LI-6400型便攜式光合儀熒光葉室操作說明進行操作，記錄初始熒光（F0）、最大熒光（Fm）、PSⅡ的實際利用量子產額（ФPSⅡ）、非環(huán)式電子傳遞速率（ETR）、光化學猝滅系數(shù)（qP）等熒光動力學參數(shù)。

1.2.4 葉綠體超微結構的觀察

① 樣品前處理：5月15日，隨機選取處于伸蔓期的突變體9388-1和突變親本白莎蜜1號植株各10株，8：00～9：00摘下植株頂部向下數(shù)第5片功能葉片，用去離子水迅速清洗干凈，用濾紙吸干水分，切成1 cm×1 cm的小塊在pH 6.8的2.5%戊二醛溶液中進行前固定，并置于4 ℃冰箱中保存。

② 電鏡樣品制備與觀察：前固定期間將其切成1 mm×2 mm小塊，用pH 6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，再放入2%四氧化鋨中固定1.5 h。之后用pH 6.8的磷酸緩沖液沖洗3次，用梯度10%的酒精系列脫水，從50%至100%，每級10 min。經過酒精和丙酮混合液及純丙酮將樣品中的酒精置換成丙酮，再將樣品分別浸入丙酮∶環(huán)氧樹脂812為1∶1和1∶2的混合物中40 min和1.5 h，在純環(huán)氧樹脂812中滲透24 h，然后包埋，在60 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行聚合反應。用奧地利Reichert-Jung公司的ULTRACUT-E型超薄切片機切厚度約為50～70 nm的切片，用帶有支持膜的樣品載網撈起，放入培養(yǎng)皿中，用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛在25 ℃下分別對樣品進行染色，用雙重蒸餾水沖洗干凈。然后在日本日立公司的H-7650型透射電子顯微鏡下觀察并照相。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗各項測定指標均3次重復，用DPS6.5軟件進行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)處理及圖表制作用EXCEL。

2 結果與分析

2.1 突變體與突變親本葉片光合色素含量比較

由表1可以看出，突變體9388-1的光合色素含量都要顯著低于白莎蜜1號，其中葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素的含量分別減少了79.5%、90.3%、81.5%、70.7%，表明該突變體為總葉綠素缺乏突變體，植株黃化是由葉綠素含量降低所導致的。突變體9388-1的葉綠素a/b比值為8.67，顯著高于白莎蜜1號，說明葉綠素a降低幅度小于葉綠素b，葉綠素含量和比例的變化，導致了葉色的黃化。

表1 突變體與突變親本光合色素含量

2.2 突變體與突變親本葉綠素生物合成前體物質相對含量比較

黑暗狀態(tài)下的甜瓜，由于未見光，合成的葉綠素前體物質處于積累狀態(tài)。由圖2可以看出，突變體與突變親本的5-氨基乙酰丙酸（ALA）含量差異不明顯，但膽色素原（PBG）含量差異顯著，且突變體的PBG含量顯著高于突變親本，之后突變體的各前體物質含量開始下降，且顯著低于突變親本正常株，說明突變體9388-1葉綠素合成受阻于膽色素原（PBG）與尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）之間。

圖2 突變體與突變親本葉綠素生物合成前體物質相對含量

2.3 突變體與突變親本葉綠素熒光參數(shù)比較

由表2可以看出，突變體F0、凈光合速率（Pn）、ФPSⅡ和ETR顯著低于突變親本，非光化學猝滅系數(shù)qN和NPQ顯著高于突變親本，表明這與葉綠素含量降低的趨勢一致，PSⅡ天線色素吸收光能并用于光合電子傳遞的量子產額和非環(huán)式電子傳遞效率有所降低。突變體Fm、PSⅡ原初光能轉化效率（FV/Fm）和qP與突變親本無顯著差異，說明葉綠素含量在一定范圍內的減少不會顯著影響最大熒光產物，對光化學猝滅影響不大且突變體的光化學效率相對提高。綜上表明，突變體能及時地耗散過剩的光能，對光合機構起一定的保護作用，維持正常的光合作用和能量代謝，使突變體能夠正常生長發(fā)育。

表2 突變體與突變親本葉綠素熒光動力學參數(shù) μmol·m-2·s-1

2.4 突變體與突變親本葉綠體超微結構比較

透射電鏡觀察結果如圖3所示，突變體9388-1葉綠體內部基粒片層垛疊數(shù)有所減少，基粒排列不整齊，呈線條狀；基粒片層間距離大，結構扭曲變形，排列疏松，雙層膜結構不清晰，內含物混濁，淀粉粒少；突變親本白莎蜜1號基粒片層結構有規(guī)律地緊密排列，結構完整，淀粉粒多。說明突變體的葉綠體結構比突變親本簡單，葉綠體結構發(fā)育不完整，光合產物的積累相對較少。

圖3 突變體與突變親本葉綠體超微結構比較

3 結論與討論

近年來，國內外研究者已經在多種作物中發(fā)現(xiàn)葉色突變體，其利用價值也越來越受到關注。葉色變異的性狀，在苗期可以作為鑒定雜交種純度的有效手段（Zhao et al.，2000）。本試驗選用的薄皮甜瓜葉色黃化突變體為自然突變體，其葉色黃化性狀在子葉期就開始表達，利用這一標記性狀能夠最有效地簡化良種繁育進程，同時也可為甜瓜育種提供優(yōu)良的種質資源。

葉色變異常常伴隨著一系列復雜的代謝過程。在一定條件下，葉綠素合成代謝、葉綠體發(fā)育等都是多層次、多元化的反應。葉色變異與葉綠素含量和葉綠體結構有直接關系（趙云 等，2003）。葉綠素的生物合成途徑受阻，會影響葉綠素的合成，從而影響葉綠體的正常發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的光合色素都包埋在類囊體膜中，葉綠體內部結構發(fā)育缺陷，影響葉綠素及其他光合色素的穩(wěn)定性，最終改變葉綠體各種色素的含量與比例，最終導致葉色變異（Chen et al.，2005）。不同類型的葉色突變體，光合色素的組成和含量、葉綠素生物合成受阻部位存在差異，葉綠素熒光參數(shù)和葉綠體內部結構發(fā)育狀況也各不相同。因此，有必要對甜瓜葉色突變體光合系統(tǒng)的超微結構、葉綠素代謝變化等葉片內部的生理生化指標進行比較分析。

本試驗結果表明，突變體9388-1與白莎蜜1號的光合色素差異明顯，且為總葉綠素缺失型突變體。在葉綠素生物合成過程中，合成途徑阻礙發(fā)生在膽色素原（PBG）與尿卟啉原Ⅲ（UrogenⅢ）之間，受阻部位與崔海瑞等（2001）對水稻葉色突變體生物合成特性研究結果不一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)突變體葉綠素的合成受阻、葉綠體內部結構發(fā)育不良，使葉綠素合成失去了可依托的物質基礎，使葉綠素的合成陷于不正常的停滯狀態(tài)，改變了光合色素各成分的含量及比例，最終導致葉色發(fā)生變異。在一定范圍內隨葉綠素含量的減少，突變體9388-1光化學效率有所提高，且能及時地以熱能的形式耗散光能，對光合機構起一定的保護作用，維持正常的光合作用和一系列的生理代謝過程，這與Xu等（1994）對大豆葉綠素缺失突變體葉綠素熒光參數(shù)的分析結果一致。

隨著甜瓜全基因組測序的完成，甜瓜葉色突變體的研究已經開始進入新的模式。本試驗結果從生理水平上揭示了甜瓜突變體葉色黃化的機理，為今后開展分子生物學方面的研究奠定了基礎。植物葉色發(fā)生突變的機制一般是受內在和外界環(huán)境因素的影響，導致基因發(fā)生突變。因此，葉色黃化的內外在因素與突變基因之間的關系還有待于進一步深入研究。

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