甄 瑾，李潤(rùn)今，王梅玲

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種常見(jiàn)的老年神經(jīng)變性疾病，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和精神異常，嚴(yán)重影響患者的日常生活質(zhì)量，為家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。AD的病因至今尚未明了，其發(fā)病機(jī)制目前有多種學(xué)說(shuō)，過(guò)度炎癥反應(yīng)在AD的發(fā)病和進(jìn)展中的重要作用逐漸被人們重視并嘗試用抗炎藥物治療AD。

淫羊藿又名仙靈脾，是我國(guó)傳統(tǒng)補(bǔ)益類中藥，其化學(xué)成分主要為黃酮類化合物、多糖、木脂素等。其中以黃酮類化合物淫羊藿苷（Icariin，ICA）含量較多。現(xiàn)已證明ICA具有植物雌激素樣作用、抗氧化作用、抗炎作用，而這些生物活性作用與神經(jīng)功能維持密切相關(guān)。在治療AD的中醫(yī)方劑中淫羊藿也占有重要地位。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察ICA對(duì)AD炎癥模型大鼠的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。通過(guò)側(cè)腦室注射脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)大鼠AD炎癥模型；ICA連續(xù)灌胃后，通過(guò)八臂迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)AD炎癥模型大鼠空間辨別學(xué)習(xí)記憶能力的測(cè)試，觀察ICA對(duì)AD炎癥模型大鼠腦機(jī)能障礙的保護(hù)作用；通過(guò)免疫組化法分析AD炎癥模型大鼠海馬內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fi－brillary acidic protein，GFAP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF－α）、白細(xì)胞介素6 （interleukin 6，IL－6）的表達(dá)，初步探討ICA對(duì)AD炎癥模型大鼠腦機(jī)能障礙保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 RM八臂迷宮分析測(cè)試系統(tǒng)；ZH－藍(lán)星B型腦立體定位儀；ZH－RXZ型柔性顱骨鉆；脂多糖購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)：127K4048；S－P試劑盒、DAB顯色液購(gòu)自天津市津脈基因測(cè)繪有限公司；抗TNF－α多克隆抗體濃縮型購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers公司，批號(hào)：R049Q574；抗GFAP多克隆抗體濃縮型購(gòu)自美國(guó)NeoMarkers公司，批號(hào)：R087Q574；JD801圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自江蘇省捷達(dá)科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康普通成年雄性Wistar大鼠45只，體重200g～260g，購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為清潔級(jí)動(dòng)物，動(dòng)物合格證號(hào)為：SCXK（蒙）2002－0001，分組分籠飼養(yǎng)，充分光照，每12h明暗交替，控制室溫18℃～21℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，在進(jìn)行八臂迷宮實(shí)驗(yàn)前限制大鼠飲食，使其體重維持在自由進(jìn)食體重的80%～85%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 八臂迷宮訓(xùn)練 八臂迷宮是研究大鼠記憶能力比較常用的實(shí)驗(yàn)裝置。RM－200八臂迷宮分析測(cè)試系統(tǒng)采用紅外探測(cè)的方式跟蹤大鼠的行動(dòng)，采用微電腦控制，可自動(dòng)得出測(cè)定結(jié)果，用于藥理實(shí)驗(yàn)中研究大鼠記憶行為。迷宮中央?yún)^(qū)直徑30 cm，向四周以等角度和等長(zhǎng)度延伸八條臂（560mm×125mm×140 mm）。整個(gè)迷宮高出地面40cm。

訓(xùn)練前大鼠先在迷宮中適應(yīng)2d，每天2次。適應(yīng)時(shí)3只或4只大鼠同時(shí)置于迷宮中，自由活動(dòng)和攝取食物10min。適應(yīng)后進(jìn)行每天2次的訓(xùn)練。每次訓(xùn)練中，八臂中只有四臂放置了食物（分別為1、3、4、6號(hào)臂），整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均維持此順序。大鼠置于迷宮中央?yún)^(qū)，此時(shí)中央?yún)^(qū)四周用鼠門關(guān)閉15s后將門打開(kāi)，并開(kāi)啟分析測(cè)試軟件，測(cè)試定時(shí)3min。大鼠可選擇進(jìn)入任意一臂，以攝取食物。大鼠進(jìn)入有食物的臂且攝取了食物為1次正確選擇；當(dāng)大鼠正確選擇了四臂食物后或時(shí)間達(dá)3min，一次訓(xùn)練結(jié)束。分析記憶的記錄參數(shù)為錯(cuò)誤選擇的次數(shù)。重新進(jìn)入放食物臂或第1次進(jìn)入放食物臂而不攝取食物為工作記憶錯(cuò)誤（working memory error，WME），進(jìn)入不放食物臂稱為參考記憶錯(cuò)誤（reference memory error，RME），兩者之和為總記憶錯(cuò)誤（total error，TE）。連續(xù)5次TE≤1，同時(shí) WME＝0為訓(xùn)練成功。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 八臂迷宮訓(xùn)練成功的Wistar大鼠36只隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、低劑量組［ICA 30mg／（kg·d）］、高劑量組［ICA120mg／（kg·d）］，每組 Wistar大鼠9只。

1.3.3 癡呆大鼠模型的制備 大鼠八臂迷宮訓(xùn)練成功后次日通過(guò)側(cè)腦室注射LPS溶液誘導(dǎo)AD炎癥模型。大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40mg／kg～50mg／kg）后，固定于腦立體定向儀上，剪去頭頂部毛發(fā)，碘酊消毒后切開(kāi)皮膚，參照George Paxinos［1］的《大鼠腦立體定位圖譜》，選擇右側(cè)側(cè)腦室為注射靶區(qū)，于前囟向后1.0mm，中線旁開(kāi)1.6mm處，用柔性顱骨鉆鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器緩慢自腦表面垂直進(jìn)針3.4 mm，將5μg／μL LPS溶液10μL緩慢注入，留針2min后緩慢撤針，縫合切口。對(duì)照組則注入等體積無(wú)菌生理鹽水。

1.3.4 八臂迷宮實(shí)驗(yàn) 造模后次日八臂迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠的空間記憶能力以判定模型的成敗。八臂迷宮測(cè)試系統(tǒng)記錄分析大鼠的RME、WME、TE，每只大鼠測(cè)試兩次，取平均值。大鼠用藥結(jié)束后再次通過(guò)八臂迷宮測(cè)試系統(tǒng)記錄分析大鼠的RME、WME、TE以觀察藥物的療效，每只大鼠測(cè)試兩次，取平均值。

1.3.5 給藥方法 大鼠側(cè)腦室注射后次日起，連續(xù)相應(yīng)灌胃14d，每天1次，對(duì)照組和模型組給予蒸餾水灌胃，低劑量組給予ICA 3 0mg／（kg·d）連續(xù)灌胃，高劑量組給予ICA 1 2 0 mg／（kg·d）灌胃。給藥期間堅(jiān)持每天兩次八臂迷宮訓(xùn)練。

1.3.6 取材及組織處理 八臂迷宮分析測(cè)試完成后24h內(nèi)，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40mg／kg～50mg／kg）。開(kāi)胸，縱向切開(kāi)心包膜，用紗線在動(dòng)脈弓下打一松結(jié)，然后用50mL注射器選用9號(hào)針頭，從左心室向主動(dòng)脈方向刺入；針頭刺入后勿使其移動(dòng)，隨手將紗線扎緊固定，再在右心室開(kāi)一孔放血，并同時(shí)快速灌注生理鹽水，直至右心室流出液變清亮，然后4%的多聚甲醛繼續(xù)灌注直至分布全身，繼續(xù)固定2h，斷頭取腦，4%的多聚甲醛固定6h。經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后進(jìn)行大鼠海馬冠狀位切片，片厚4μm。

1.3.7 免疫組織化學(xué)法 參照津脈公司提供的免疫組化試劑盒檢測(cè)步驟進(jìn)行免疫組化S－P法染色檢測(cè) GFAP、TNF－α、IL－6的表達(dá)。

1.3.8 結(jié)果判定 GFAP、TNF－α和IL－6蛋白均定位于胞漿，細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，利用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行分析，測(cè)定灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均數(shù)比較用單因素方差分析，組間比較用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 淫羊藿苷對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 與模型組比較，高劑量組 WME、RME、TE顯著減少（P＜0.01），低劑量組WME、RME、TE無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠TE、RME、WME比較（±s）

表1 各組大鼠TE、RME、WME比較（±s）

TE RME WME組別 n模型組 9 8.28±1.362） 5.50±1.042） 2.78±0.812）低劑量組 9 7.56±1.292） 5.00±0.912） 2.56±0.862）高劑量組 9 4.56±0.921）2） 3.00±0.591）2） 1.50±0.791）2）對(duì)照組 9 0.72±0.751） 0.44±0.621） 0.28±0.461）與模型組比較，1）P＜0.01；與對(duì)照組比較，2）P＜0.01

2.2 各組大鼠海馬內(nèi)GFAP的表達(dá) 免疫組化染色顯示各組海馬內(nèi)均有GFAP的表達(dá)，且表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。海馬GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，胞漿呈棕黃色，周圍有放射狀突起，突起多有分支，形似蜘蛛狀。各組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)目以及GFAP的表達(dá)強(qiáng)度不同。對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞胞體瘦小，散在分布，染色較淺，突起纖細(xì)；模型組切片中可見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞胞體肥大，突起增多增粗延長(zhǎng)，呈梭形或三角形，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，染色較深；低劑量組較上述變化減輕；高劑量組明顯減輕，未見(jiàn)明顯增生肥大的GFAP陽(yáng)性細(xì)胞，與模型組比較，胞體變小，突起變細(xì)，染色強(qiáng)度減弱。與模型組比較，高劑量組GFAP的表達(dá)明顯減少（P＜0.01），但仍明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組與模型組比較，GFAP表達(dá)有減少趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠海馬內(nèi)TNF－α的表達(dá) 免疫組化染色檢測(cè)海馬內(nèi)TNF－α的表達(dá)，各組海馬內(nèi)均有TNF－α的表達(dá)，模型組切片中胞漿可見(jiàn)明顯的棕黃色顆粒，表達(dá)強(qiáng)，表達(dá)細(xì)胞多；對(duì)照組表達(dá)弱，表達(dá)細(xì)胞少；治療組隨給藥劑量的增加表達(dá)減弱，甚至達(dá)正常水平。圖象分析測(cè)試顯示，模型組平均灰度值最低，提示模型組TNF－α強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；對(duì)照組平均灰度值最高，TNF－α弱表達(dá)；治療組平均灰度值均較模型組減低。與模型組比較，高劑量組TNF－α的表達(dá)明顯減少（P＜0.01），但仍明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組TNF－α的表達(dá)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.4 各組大鼠海馬內(nèi)IL－6的表達(dá) 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠海馬內(nèi)IL－6的表達(dá)，模型組切片中胞漿可見(jiàn)明顯的棕黃色顆粒；對(duì)照組表達(dá)弱，表達(dá)細(xì)胞少；各治療組間介于模型組和對(duì)照組之間。圖象分析測(cè)試顯示，模型組平均灰度值最低，提示模型組IL－6表達(dá)多，表達(dá)強(qiáng)；生理鹽水對(duì)照組平均灰度值最高，IL－6表達(dá)少、表達(dá)弱；各治療組平均灰度值均較模型組減低。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，與模型組比較，高劑量組IL－6的表達(dá)明顯減少（P＜0.01），但仍明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）；低劑量組IL－6的表達(dá)與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬內(nèi)GFAP、TNF－α、IL－6的平均灰度值（±s）

表2 各組大鼠海馬內(nèi)GFAP、TNF－α、IL－6的平均灰度值（±s）

IL－6模型組 9 107.19±10.582） 133.16±14.522） 131.52±14.272）組別 n GFAP TNF－α低劑量組 9 110.95±13.522） 138.02±10.982） 136.61±13.962）高劑量組 9 157.45±10.211）2）164.55±14.581）2）159.94±11.081）2）對(duì)照組 9 170.12±8.951） 174.09±12.101） 173.17±16.501）與模型組比較，1）P＜0.01；與對(duì)照組比較，2）P＜0.01

3 討 論

阿爾茨海默病是老年癡呆中最常見(jiàn)的病因。研究資料表明，AD患者腦內(nèi)持續(xù)存在著慢性炎癥反應(yīng)，并可能是其他病理特征形成和發(fā)展的誘發(fā)因素［2］。AD時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生多種致炎因子，包括IL－1、IL－6、TNF－α、NO等，這些因子的過(guò)度表達(dá)和復(fù)雜的相互作用對(duì)神經(jīng)元有損害作用，同時(shí)又可以反過(guò)來(lái)刺激膠質(zhì)增生反應(yīng)，進(jìn)一步加劇神經(jīng)元的退行性變。因而腦膠質(zhì)細(xì)胞及其所產(chǎn)生和分泌的細(xì)胞因子在AD腦組織病理變化的發(fā)生發(fā)展中有重要意義。

GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，通過(guò)研究GFAP表達(dá)的強(qiáng)弱可反映在正常及病理?xiàng)l件下星形膠質(zhì)細(xì)胞功能狀態(tài)［3］。研究表明反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞參與了老年斑的發(fā)生與發(fā)展，并加重老年性癡呆的病理改變，促進(jìn)病程的發(fā)展［4，5］。

Landfield等［6］發(fā)現(xiàn)老年記憶損害的大鼠海馬內(nèi)的星形細(xì)胞肥大和神經(jīng)元丟失，并認(rèn)為GFAP陽(yáng)性星形細(xì)胞與老年學(xué)習(xí)記憶減退之間有一定的相關(guān)性。另外，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌巨噬細(xì)胞炎性蛋白，在組織損傷區(qū)參與炎癥反應(yīng)，影響中樞膽堿神經(jīng)Ach的作用，影響中樞膽堿神經(jīng)突觸的傳遞過(guò)程［7，8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD模型組大鼠海馬內(nèi)GFAP表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，且胞體增大，突起增粗，提示星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活；給予ICA治療后，AD炎癥模型GFAP表達(dá)明顯減少，表明ICA可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化增生，推測(cè)作用機(jī)制可能為ICA的抗炎作用抑制了模型的炎性反應(yīng)，從而抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生。

TNF－α主要是由巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞產(chǎn)生的多肽類細(xì)胞因子，正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)由神經(jīng)元產(chǎn)生低水平的TNF－α。AD病人淀粉樣蛋白斑塊相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞TNF－α表達(dá)水平升高。AD的神經(jīng)病理過(guò)程中伴有大量TNF－α等炎性細(xì)胞因子的存在，異常高度表達(dá)的TNF－α可能與AD的發(fā)病有關(guān)［9］。本實(shí)驗(yàn)觀察到模型組與對(duì)照組比較，TNF－α表達(dá)明顯增加，ICA治療后TNF－α表達(dá)明顯減少，提示AD模型大鼠炎癥反應(yīng)明顯，TNF－α釋放增加，ICA治療能抑制AD模型大鼠的炎癥反應(yīng)，從而使TNF－α的表達(dá)減少。

IL－6在大腦中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，在正常情況下，IL－6可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化，支持細(xì)胞存活，還能保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)抵抗毒性物質(zhì)、促進(jìn)細(xì)胞重建、抵抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用［10］。在高鉀、谷氨酸和脂多糖等刺激因子的作用下，神經(jīng)元表達(dá)IL－6增加，可介導(dǎo)炎癥、脫髓鞘和星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)多癥。在神經(jīng)功能紊亂時(shí)，例如神經(jīng)變性、感染、缺血、多發(fā)性硬化癥，IL－6表達(dá)明顯增加。過(guò)度表達(dá)的IL－6與AD之間的關(guān)系十分復(fù)雜，可能具有雙重作用，它既能啟動(dòng)神經(jīng)元損傷后的存活效應(yīng)，也能導(dǎo)致神經(jīng)元變性［11－13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AD 模型IL－6表達(dá)明顯增加，ICA治療后IL－6的表達(dá)較模型組明顯減少，提示ICA治療能抑制AD模型的炎癥反應(yīng)，從而使IL－6的表達(dá)減少；或者是ICA能夠抑制IL－6的表達(dá)，從而抑制AD模型的炎癥反應(yīng)。

總之，ICA能夠改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能是通過(guò)抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增殖，抑制炎癥因子的釋放實(shí)現(xiàn)的。但確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究和闡明。

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