溫志丹，高大文，李 喆，吳唯民

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，150090哈爾濱;2.美國斯坦福大學(xué)土木與環(huán)境工程系，CA94305斯坦福)

鄰苯二甲酸酯(phthalic acid ester，PAEs)，又名酞酸酯，是一類廣泛應(yīng)用于塑料、涂料、農(nóng)藥、橡膠、個人護理用品等領(lǐng)域的人工合成化學(xué)添加劑［1］，在生產(chǎn)、使用和廢棄過程中，能夠逐漸從其基體材料中遷移至外界環(huán)境中［2-3］，已成為全球環(huán)境最普遍的重要有機污染物之一，在大氣、土壤和水體中都檢測到PAEs的存在［4-6］.PAEs具有致畸性、致突變性、致癌性及生殖毒性［7-8］，美國EPA已將其列入129種［9］重點控制污染物名單中，在我國也是環(huán)境優(yōu)先控制污染物［10］.由于具有較強的疏水性，大量PAEs吸附于水體底部的沉積物或土壤中［11］.但在自然環(huán)境條件下，其光解和水解速度極其緩慢，生物降解是相對重要的轉(zhuǎn)化過程［12］.大量研究也表明好氧或厭氧條件下的微生物代謝分解是影響PAEs類增塑劑在環(huán)境中行為和歸趨的主要途徑，是該類物質(zhì)在自然環(huán)境中完全礦化的主要過程之一.

從長期處理生活污水的東北某人工濕地土壤和污水處理廠活性污泥中，分離篩選出7株鄰苯二甲酸酯降解能力較高的菌株，運用常規(guī)生理生化試驗和分子生物學(xué)手段對這7株菌進行鑒定，并觀察其降解特性.以期為今后從自然界中分離選育降解鄰苯二甲酸酯的優(yōu)勢菌種，構(gòu)建具有高效降解性能的微生物體系，及鄰苯二甲酸酯污染土壤的生物修復(fù)研究奠定基礎(chǔ).

1 實驗

1.1 實驗材料

1.1.1 供試土壤樣品的采集和處理

土壤樣品采集于2012年6月.采樣濕地為遼寧省昌圖縣某處理生活污水的人工濕地，該濕地的地理位置為124°4＇44″N～124°4＇59″N，42°45＇43″E～42°45＇58″E.采樣前對所用器皿進行高溫滅菌，并用丙酮及超純水清洗，取樣前用所在采樣點的水樣潤洗.采樣點為該人工濕地的進水口、中間段和出水口，先用滅菌后的不銹鋼采樣鏟去除表面10 cm的土壤后采樣，采用多點采集混合取樣的方式，同時采集水樣和基質(zhì)樣品.樣品采集后裝入1 L棕色磨口瓶中密封，置于裝滿冰袋的保溫箱中，并于12 h內(nèi)運回實驗室，4℃冰箱中保存.

1.1.2 藥品及化學(xué)試劑

選取結(jié)構(gòu)上具有代表性的鄰苯二甲酸酯作為研究對象，所用試劑有:鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)(美國Sigma-Aldrich股份有限公司產(chǎn)品).實驗過程中使用的正己烷有機溶劑為分析純(美國TEDIA公司產(chǎn)品).

1.1.3 培養(yǎng)基配置

細菌保存培養(yǎng)基:營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)［13］.

篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSM):每升含(NH4)2SO4，1 g;K2HPO4，0.8 g;KH2PO4，0.2 g;NaCl，0.5 g;微量元素液1 mL［14］.

120 mg/L PAEs混合物做為唯一的碳源和能源(包括20 mg/L DMP、DEP、DBP、BBP、DEHP和DOP)，pH 7.0～7.2.

1.2 實驗方法

1.2.1 PAEs降解菌的分離和富集

取5 g土壤樣品加入100 mL含PAEs的MSM培養(yǎng)基中，置于震蕩培養(yǎng)箱中120 r/min、30℃培養(yǎng)7 d;然后取1 mL上述培養(yǎng)液加入新鮮的含PAEs的MSM培養(yǎng)基中，同條件下培養(yǎng)7 d后轉(zhuǎn)接，共轉(zhuǎn)接3次.培養(yǎng)液中PAEs質(zhì)量濃度逐漸增加(120～360 mg/L).

取最終液體培養(yǎng)物0.1 mL涂布于含PAEs 120 mg/L的MSM固體培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)7 d.菌落出現(xiàn)后，分別挑取表型不同的單菌落于NA培養(yǎng)基上，進行三區(qū)劃線分離，反復(fù)分離直至在NA固體培養(yǎng)基上得到菌落特征一致的純菌落.所得純菌再次回接至MSM固體平板上，只能在含PAEs的MSM固體平板上生長的菌株，被認為具有降解利用鄰苯二甲酸酯的能力.將該菌轉(zhuǎn)接于試管斜面中(NA培養(yǎng)基)，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 細菌的形態(tài)學(xué)和常規(guī)生理生化特征

觀察菌落特征及菌體形態(tài)，并根據(jù)伯杰氏細菌鑒定手冊［15］對分離到的鄰苯二甲酸酯降解菌進行生理生化實驗.

1.2.3 16 s rRNA序列分析

采用試劑盒(柱式細菌DNAout，北京天恩澤基因科技有限公司)提取細菌基因組DNA，PCR擴增細菌16s rRNA基因，委托生工生物工程有限公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中的己知序列進行相似性分析和同源性比較.

1.2.4 PAEs降解實驗

取上述純培養(yǎng)物培養(yǎng)于NA培養(yǎng)基中，菌液OD600為1.2～1.4時，離心分離(8 000g，20 min)收集菌體，再用磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)清洗菌體，離心棄去上清液，重復(fù)3次.將洗后的菌體接種于50 mL的MSM液體培養(yǎng)基中(ρ(PAEs)=20 mg/L)，在30℃下?lián)u床培養(yǎng)3 d后離心取上清液，同時以未接菌的培養(yǎng)液作為空白對照.以上實驗重復(fù)3次.采用微波萃取法(萃取液為正己烷)提取上清液中殘余PAEs，合并萃取液，過無水硫酸鈉干燥柱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于10 mL后定容，待GCMS分析.

1.2.5 PA利用實驗

選取PAEs常見的中間降解產(chǎn)物——鄰苯二甲酸(PA)進行底物利用實驗.配制MSM培養(yǎng)液，150 mg/L PA作為唯一的碳源和能源，將與1.2.4相同處理的菌株接種至該培養(yǎng)液中培養(yǎng).以未接菌的培養(yǎng)液作為空白對照，用分光光度法連續(xù)測定培養(yǎng)液在波長600 nm下的光密度值(OD600)，衡量細菌的生長情況.同一批號樣品重復(fù)檢測3次，取平均值作為最后結(jié)果.

1.3 分析方法

樣品分析使用Agilent 6890-5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀.色譜柱為DB-5 ms(30 m×250 μm×1 μm)，氣相色譜進樣口溫度300℃;載氣為高純氦氣(99.99%)，流速2.0 mL/min;進樣量2.0 μL;溶劑延遲10 min;柱溫90℃(3 min)，以15℃/min升至320℃(7 min)，共運行25.33 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 鄰苯二甲酸酯降解菌的分離篩選

按照富集、初篩、純化和復(fù)篩的方法，在處理生活污水的人工濕地土壤樣品中分離到7株可對鄰苯二甲酸酯進行有效降解的菌株，分別為D1～D7.形態(tài)學(xué)及菌落特征見表1.其中D1，D2，D4和D5分離自人工濕地進水口位置(距進水口5 m)的土壤中，D3分離自濕地中間段的土壤中，而D6和D7分離自濕地出水口位置(距出水口5 m)的土壤中.

表1 降解菌個體及平板菌落特征

2.2 鄰苯二甲酸酯降解菌的生理生化特征

對以上7株細菌進行的甲基紅試驗、V-P測定、檸檬酸鹽利用試驗、淀粉水明膠液化試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、纖維素分解試驗、吲哚試驗等生理生化結(jié)果見表2.

表2 細菌生理生化試驗結(jié)果

2.316S rRNA序列同源性分析

提取細菌總DNA并選用細菌通用引物8f和1492r擴增其16S rRNA基因，擴增產(chǎn)物序列長度均在1 424～1 452 bp，根據(jù)測序結(jié)果，利用BLAST軟件與Genbank中已登錄的16S rRNA基因序列進行同源性比較，并利用Cluastx和MEGA 4.1等相關(guān)軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1.所有獲得的序列提交至Genebank，檢索號依次為KF113578～KF113584.經(jīng)16S rRNA基因測序及同源性比較，D1、D2與Pseudomonas sp.的同源性分別為100%和98%，D3與Enterobacter sp.的同源性在99%以上，其余5株降解菌與Rhodococcus sp.的同源性都在98%以上.

2.4 菌株對鄰苯二甲酸酯的降解

對以上篩選出的7株菌進行PAEs降解率測定，結(jié)果如圖2所示.可以看出，在以PAEs為唯一碳源的培養(yǎng)基中，7株菌均能有效降解并利用鄰苯二甲酸酯，但降解率各不相同.菌株D1和D7對PAEs的降解效果明顯優(yōu)于其他細菌，兩者對DMP、DBP和DEHP的降解率均在70%以上，而菌株D2的降解率都低于70%，其余菌株對不同種類PAEs的降解率在30%～99%.

圖1 16S 人RNA測序及同源性分析

圖2 不同菌株培養(yǎng)3 d后對DMP、DBP和DEHP的降解率

由圖2還可以看出，菌株對PAEs的降解能力隨側(cè)鏈烷基鏈的增長而下降，相對分子質(zhì)量較小的DMP的降解率明顯高于長鏈DEHP.培養(yǎng)3 d后，所有菌株對DMP降解率均達70%以上，其中D3、D4、D5和D7達95%以上，基本能完成終極降解;但對DEHP的降解率均在50%左右，僅有兩株菌達到80%.這與相對分子質(zhì)量高的PAEs空間位阻大、不容易被微生物降解利用的報道一致［16］.此外，從表3可以看出，人工濕地中微生物對PAEs的降解能力與其側(cè)鏈烷基鏈的長度也有關(guān).人工濕地進水中均檢測到DMP、DBP和DEHP，但是在距進水口5 m左右土壤中已檢測不到DMP，DBP和DEHP在人工濕地沿程土壤中的含量逐漸減少，在距出水口5 m左右的土壤中已經(jīng)檢測不到DBP，但DEHP仍然大量殘留.這說明濕地微生物對DMP的去除效果最好，其次是DBP，對長鏈DEHP的降解能力較差.

表3 人工濕地進水及土壤樣品中鄰苯二甲酸酯的含量

在PAEs的微生物好氧降解過程中，首先由微生物分泌的水解酶將雙酯轉(zhuǎn)化為單酯與相應(yīng)的醇，再進一步將單酯轉(zhuǎn)化為PA與相應(yīng)的醇，而接下來PA的降解是整個降解過程的關(guān)鍵［17］.并非所有的PAEs降解菌都能降解利用PA，Wu等［18］的研究表明，從活性污泥中分離得到的Gordonia sp.strain JDC-2能夠?qū)OP降解為PA，但是不具備利用PA的能力，造成PA在培養(yǎng)體系中大量累積.因此，菌株能否利用PA對于是否能夠?qū)崿F(xiàn)對PAEs的終極降解至關(guān)重要.

2.5 菌株對鄰苯二甲酸的利用

菌株在以PA為唯一碳源培養(yǎng)時的OD600連續(xù)監(jiān)測結(jié)果見圖3.分離到的7株菌均能利用PA，其中D4、D5和D7在以PA為唯一碳源培養(yǎng)時的生長較迅速，培養(yǎng)約2 d后進入對數(shù)生長期;D1和D2在PA培養(yǎng)液中的生長遲滯期較長，培養(yǎng)3 d后才進入對數(shù)生長期，且穩(wěn)定期較短，在監(jiān)測周期為24 h時，并未成功監(jiān)測到穩(wěn)定期就已經(jīng)進入衰亡期;D3和D6生長緩慢，菌體濃度一直較低.

圖3 菌株以PA為唯一碳源時的生長曲線

培養(yǎng)7 d后，取培養(yǎng)液離心后對上清液中殘余的PA進行分析(圖4).菌株D4對PA的利用率最高(達39%)，其余菌株的利用率在13%～34%.其中菌株D3和D6對PA的利用率相對較低，分別為23%和13%，這應(yīng)該是造成其生長緩慢的原因.本研究中分離得到的7株P(guān)AEs降解菌均能降解利用PA，這說明它們可能通過PA途徑來實現(xiàn)PAEs的完全降解，有待進一步證實.

圖4 不同菌株培養(yǎng)7 d后對PA的利用率

3 結(jié)論

1)從某人工濕地土壤樣品中分離篩選出7株以PAEs為唯一碳源的高效PAEs降解細菌D1～D7.經(jīng)生理生化、形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列分析，鑒定D1、D2與銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)高度同源，相似度分別為100%和99%;D3與產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)的同源性在99%以上;其余4株降解菌與紅球菌屬(Rhodococcussp.)的同源性均在98%以上.

2)間歇培養(yǎng)3 d的實驗表明，菌株D1和D7對PAEs的降解效率高于其他菌株，兩者對DMP、DBP和DEHP的降解率均在70%以上;菌株對PAEs的降解能力隨PAEs側(cè)鏈烷基鏈的增長而下降，對相對分子質(zhì)量較小的DMP的降解率明顯高于長鏈DEHP.

3)這7株P(guān)AEs降解菌均能降解利用PA，說明可能具有完全礦化降解PAEs的潛力，有待進一步證實.

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