單輝國，茅國新，潘驥群，周雪峰

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)，肺癌發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤的首位，近年來，我國肺癌的發(fā)病率和死亡率也一直呈明顯上升趨勢。非小細胞肺癌(Nun-small cell lung cancer，NSCLC)為肺癌最常見類型，在肺癌中約占80%，雖然近年來多學科綜合治療模式的進展使得NSCLC的治療效果顯著提高，但NSCLC的5年生存率仍然低于15%［1］。因此，探索新的治療模式、新的治療藥物是肺癌研究的熱點之一。Bonnet等［2］經(jīng)實驗研究證實，用于治療乳酸酸中毒和線粒體遺傳性疾病的小分子藥物二氯乙酸鹽(DCA)可以在體外殺死肺、腦、乳腺、子宮內(nèi)膜多種腫瘤細胞，同時，DCA能激活腫瘤細胞內(nèi)線粒體的功能，從而激活細胞內(nèi)源性凋亡通路，達到殺傷癌細胞的目的。Cao等［3］研究也證實了DCA可誘導前列腺腫瘤細胞凋亡。本實驗觀察二氯乙酸鈉(DCA-Na)、DDP聯(lián)合應(yīng)用對人肺腺癌A549細胞株的影響，為DCA-Na臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 DDP購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司;DCA-Na購自 Sigma-Aldrich公司;人肺腺癌A549細胞株購自中國科學院生物研究所細胞庫;四氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司;RPMI-1640購自GIBCO。所有細胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，pH值為6.8～7.2，培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，48 h換液一次。

1.2 MTT法檢測DCA-Na、DDP對A549細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的A549細胞(每孔含細胞數(shù) 1×105/mL)種入 96孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL培養(yǎng)基。置37℃、95%濕度、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。分別加入:單藥組DCA-Na的終濃度分別為18.75、37.5、75、150、300 μg/mL;單藥組 DDP 的終濃度分別為 0.08、0.4、2、10、50 μg/mL;細胞對照組(細胞液 100 μL+RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL)。各組設(shè)3個復(fù)孔。每塊板設(shè)一個空白組，只加等量的RPMI 1640培養(yǎng)液，不含細胞與藥物。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL。把96孔板置于搖床上搖動1 min，以充分混勻待檢測體系，并在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4～6 h。每孔加入100 μL的DMSO，輕輕震蕩10 min。用酶標儀在570 nm波長下測定吸光度(OD值)，取平均OD值。按以下公式計算各組抑制率(IR)fa=［1-處理組OD值/對照組OD值］×100%。

1.3 MTT法檢測DCA-Na聯(lián)合DDP對A549細胞增殖的影響 DDP終濃度0.08、0.4、2 μg/mL分別與 DCA-Na 終濃度為 18.75、37.5、75、150、300 μg/mL聯(lián)合，同時設(shè)對照組(加 A549細胞)、不加藥物空白組(不加A549細胞及藥物，只加培養(yǎng)液)。各組設(shè)3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL。每孔加入100 μL的DMSO，輕輕震蕩10 min。用酶標儀在570 nm波長下測定OD值，取平均OD值。按以下公式計算各組抑制率(IR)fa=［1-處理組OD值/對照組OD值］×100%。按金氏公式［4］判斷DCA-Na和DDP聯(lián)用的性質(zhì)Q=E(A+B)/［EA+(1-EA)×EB］。E(A+B)為兩藥合用的抑制率，EA、EB為兩藥單用的抑制率。Q=0.85～1.15表示兩藥作用相加，Q＞1.15表示兩藥作用協(xié)同，Q＜0.85表示兩藥作用相互拮抗。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集24、48、72 h 經(jīng) DCA-Na 75 μg/mL、DDP 2 μg/mL 單獨及聯(lián)合作用的細胞，并用胰酶消化制成單細胞懸液，使用未加藥細胞作為對照組，按常規(guī)消化收集;按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒使用說明，取100 μL的細胞懸液加入5 mL流式管中，并加入5 μL FITC 和 10 μL 20 μg/mL PI的溶液;在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，1 h內(nèi)進行流式細胞儀的檢測(激發(fā)波長Ex=488 nm);各組細胞均重復(fù)實驗3次。

1.5 Caspase-3、8、9活性檢測 將處于對數(shù)生長期的A549細胞分為4組:未加藥細胞對照組、DCA-Na 37.5、75、150 μg/mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12、24、48、72 h，定時取樣檢測。Caspase-3、8、9 活性檢測按 Caspase-3、8、9 分光光度法檢測試劑盒說明進行。

1.6 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果用±s表示，進行方差分析及SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DCA-Na對人肺腺癌A549細胞株的生長抑制作用 濃度為 18.75、37.5、75、150、300 μg/mL的DCA-Na分別作用于A549細胞后，與對照組比較，OD值下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。DCA-Na作用于A549細胞48 h的半數(shù)抑制濃度(Half inhibitory concentration，IC50)值 為140.21 μg/mL。

2.2 DDP對人肺腺癌A549細胞株的生長抑制作用 濃度為0.08、0.4、2、10、50 μg/mL 的 DDP 分別作用于A549細胞后，其OD值與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。DDP作用于A549 細胞 48 h 的 IC50為1.42 μg/mL。

2.3 DCA-Na聯(lián)合DDP對人肺腺癌A549細胞株的生長抑制作用 濃度為 18.75、37.5、75、150 μg/mL的 DCA-Na 分別與0.08、0.4、2 μg/mL的DDP聯(lián)合作用于A549細胞后，其OD值與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。濃度為 18.75、37.5、75、150 μg/mL 的 DCA-Na 分別與0.08 μg/mL的 DDP聯(lián)合，其抑制率與同濃度DDP單藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。濃度為 37.5、75、150 μg/mL 的 DCA-Na 分別與0.4、2 μg/mL的 DDP聯(lián)合，其抑制率與同濃度DDP單藥組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。按照兩藥合用效果公式計算，濃度為75 μg/mL的 DCA-Na與2 μg/mL 的 DDP 聯(lián)合在48 h的Q值為1.16，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 經(jīng)FCM檢測，75 μg/mL DCA-Na、2 μg/mL DDP 單獨及聯(lián)合作用于A549細胞24、48、72 h后，A549細胞凋亡率見表1。結(jié)果顯示，A549細胞經(jīng)DCA-Na和DDP單獨及聯(lián)合作用后出現(xiàn)明顯的凋亡，并隨時間延長，凋亡率增加。加藥組與對照組、聯(lián)合組與單藥組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。圖1顯示，未加藥對照組24 h后的早期凋亡率為2.52%，晚期凋亡率為2.71%;A549細胞加入DCA-Na 75 μg/mL 24 h后的早期凋亡率為13.51%，晚期凋亡率為6.72%;加入DDP 2 μg/mL 24 h后早期凋亡率為16.79%，晚期凋亡率為8.05%;聯(lián)合用藥組早期凋亡率為24.53%，晚期凋亡率為12.14%。

表1 DCA-Na、DDP 單獨及聯(lián)合作用 A549 細胞凋亡率(珔x ±s，n=3，%)

圖1 DCA、DDP單獨及聯(lián)合誘導A549細胞凋亡的FCM檢測結(jié)果

圖2 DCA對A549細胞Caspase-3活性的影響

2.5 DCA-Na對 A549細胞 Caspase-3、8、9 活性的影響 實驗發(fā)現(xiàn)，DCA-Na 37.5、75、150 μg/mL 作用于A549細胞12 h后，Caspase-3的活力開始升高，24 h達到峰值，之后逐漸下降，72 h內(nèi)一直高于對照組。各加藥組與對照組比較，72 h內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖2)。DCA-Na作用于A549細胞12 h后，Caspase-8的活性開始升高，24 h達到峰值，之后逐漸下降，但直至第72 h仍高于對照組。各加藥組與對照組比較72 h內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖 3)。DCA-Na作用于A549細胞，12 h后Caspase-9的活力開始升高，24 h達到峰值，之后逐漸下降，72 h內(nèi)一直高于對照組。各加藥組與對照組比較，72 h內(nèi)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖3 DCA對A549細胞Caspase-8活性的影響

圖4 DCA對A549細胞Caspase-9活性的影響

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，DDP是肺癌化療常用藥物之一，其作用機制主要是引起DNA損傷，在糖酵解抑制劑的作用下，使ATP生成減少，從而使損傷的DNA無法復(fù)制，促進其化療的作用效果［5］。有研究證實［6］，DCA能使線粒體去極化并使活性氧及線粒體內(nèi)的凋亡誘導因子流出增多，從而促進腫瘤細胞凋亡，使腫瘤細胞對化療藥物更加敏感。本實驗用MTT法對檢測DCA-Na、DDP單獨及聯(lián)合作用于人肺腺癌A549細胞株后，結(jié)果顯示，DCA-Na、DDP對A549細胞均有抑制作用，但只有選擇合適濃度的DCA與DDP聯(lián)合才有較好的療效。

細胞凋亡主要通過Caspase的激活而發(fā)生，其對機體穩(wěn)態(tài)的保持十分重要，細胞凋亡調(diào)控的失衡與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［7］。目前已有研究表明，許多抗腫瘤藥物均可誘導腫瘤細胞凋亡，故誘導腫瘤細胞凋亡己經(jīng)成為腫瘤治療的新思路［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用DCA在體外對人肺腺癌細胞系A(chǔ)549、人乳腺癌細胞系MCF-7、惡性膠質(zhì)瘤細胞系M059K進行抑制試驗，發(fā)現(xiàn)DCA具有抑制腫瘤細胞生長、促進凋亡的作用，其機制抑制線粒體丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)，從而激活丙酮酸脫氫酶，產(chǎn)生大量的乙酰輔酶A，后者進入線粒體后重啟檸檬酸循環(huán)，促進了葡萄糖的氧化磷酸化。同時，因大量自由基的釋放和膜電位的降低打開了線粒體介導的通路，促進細胞凋亡，且可能與降低Survivin基因表達并抑制凋亡信號轉(zhuǎn)導過程中Caspase-3的活性有關(guān)［2］。Wong 等［9］研究證實，DCA 在體外可以誘導子宮內(nèi)膜癌細胞系A(chǔ)N3CA凋亡，并與上游Caspase-9自我催化激活有關(guān)。

Caspase是介導細胞凋亡的重要蛋白酶，一旦其被激活，細胞死亡將不可避免，其激活有死亡受體路徑和線粒體路徑2條途徑［10］。在死亡受體路徑(又稱為外源性途徑)中，細胞膜表面的TNF家族受體接受外源性刺激信號后，通過胞質(zhì)中的蛋白網(wǎng)絡(luò)傳導至上游的啟動子蛋白Caspase-8，激活啟動凋亡程序［11］。在線粒體路徑(又稱為內(nèi)源性途徑)中，激活Caspase酶是凋亡過程中的關(guān)鍵步驟，線粒體膜通透性及跨膜電位(△Ψm)的改變使細胞色素C(Cyt c)釋放到胞漿，與ATP、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合成復(fù)合物，激活Caspase-9［12］。已有研究證實［13］，DCA 能激活線粒體途徑的凋亡通路。本實驗應(yīng)用分光光度法檢測Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 的蛋白活性，結(jié)果DCA-Na誘導A549細胞凋亡可能與下游效應(yīng)中的Caspase-3以及上游始動中的Caspase-8、Caspase-9蛋白的激活有關(guān)，在DCA-Na誘導人肺腺癌A549細胞株凋亡中，可能外源性和內(nèi)源性兩條途徑都有作用。

參與細胞凋亡的調(diào)控因素眾多，DCA-Na、DDP單藥及兩藥聯(lián)合可能還存在其他誘導腫瘤細胞凋亡的途徑及機制，尚有待進一步的研究。相信隨著研究的不斷深入，DCA抗腫瘤作用的機制也將逐漸被闡明。

:

［1］Inoue Y，Gika M，Abiko T，et al.Bcl-2 over expression enhances in vitro sensitivity against docetaxel in non-small cell lung cancer［J］.Oncol Rep，2005，13(2):259-264.

［2］Bonnet S，Archer SL，Allalunis-Turner J，et al.A mitochondria-K+channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth［J］.Cancer cell，2007，11(1):37-51.

［3］CaoWG，Yacoub S，Rosser CJ，et al.Dichlorocetate sensitizes both Wild-Type and over expressing Bcl-2 prostate cancer cells in vitro to radiation［J］.Prostate，2008，68(11):1223-1231.

［4］邢麗華，張珍詳，徐永健，等.環(huán)氧化酶-2抑制劑聯(lián)合順鉑治療肺癌的實驗研究［J］.中國肺癌雜志，2004，7(3):191-194.

［5］Yamada，Tomida A，Yun J，et al.Cellular sensitization to cisplatin and carboplatin with decreased removal of platinum-DNA adduct by glucose-regulated stress［J］.Cancer Chemother Pharmacol，1999，44(1):59-64.

［6］Michelakis ED，Webster L，Mackey JR.Dichloroacetate as a potential metabolictargeting therapy for cancer［J］.Br J Cancer，2008，99(7):989-994.

［7］陳莉，程純.現(xiàn)代病理學臨床研究的基本問題［M］.北京:科學出版社，2007:18-32.

［8］Lee RH，Song JM，Park MY，et al.Cisplatin-induced apoptosis by translocation of endogenous Bax in mouse collecting duct cells［J］.Biochem Pharmacol，2001(62):1013-1023.

［9］Wong JYY，Huggins GS，Debidda M，et al.Dichloroacetate induces apoptosis in endometrial cancer cells［J］.Gynecol Oncol，2008，109(3):394-402.

［10］袁長青，丁振華.Caspase的活化及其在細胞凋亡中的作用［J］.生理科學進展，2002，33(3):220.

［11］葉月芳，周韌.Caspase-8的研究進展［J］.國外醫(yī)學:生理、病理科學與臨床分冊，2004，24(2):129-131.

［12］Brown NM，Martin SM，Maurice N，et al.Caspase inhibition blocks cell death and results in cell cycle arrest in cytokine deprived hematopoietic cells［J］.Biol Chem，2007，282(4):2144-2155.

［13］Pei Z，Chu L，Zou W，et al.An oncolytic adenoviral vector of Smac increases antiumor activity of TRAIL against HCC in human cells and in mice［J］.Hepatology，2004，39(5):1371-1381.