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        當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊的薄層鑒別與阿魏酸、芍藥苷的測(cè)定

        2013-08-28 14:33:40謝仲德方應(yīng)權(quán)李文烈夏天水
        中成藥 2013年2期
        關(guān)鍵詞:薄層芍藥批號(hào)

        謝仲德, 方應(yīng)權(quán), 李文烈, 夏天水

        (1.重慶三峽醫(yī)藥高等??茖W(xué)校藥學(xué)系,重慶萬(wàn)州 404020;2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司,河北石家莊 050035;3.成都倍特藥業(yè)有限公司,四川成都 610041)

        當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊是由當(dāng)歸、熟地黃、川芎、黨參、白芍、甘草和黃芪組成的復(fù)方制劑。具有補(bǔ)血助氣,調(diào)經(jīng)功效,用于貧血衰弱,病后、產(chǎn)后血虛以及月經(jīng)不調(diào),痛經(jīng)[1]。是在原當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒[已收載于《部頒中藥成方制劑》第10冊(cè) (WS3-B-1925-95)]的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝改良而制備的新制劑,具有療效好、服用劑量小的特點(diǎn)。采用薄層色譜法對(duì)制劑中的當(dāng)歸、川芎、白芍進(jìn)行了定性鑒別研究,采用高效液相色譜法建立阿魏酸、芍藥苷的定量測(cè)定方法。

        1 儀器與試藥

        紫外分光光度計(jì) (島津UV-3150)、恒溫水浴鍋 (余姚精益溫度儀表廠)、硅膠G(青島海洋化工有限公司)、高效液相色譜法儀 (北京創(chuàng)新通恒科技有限公司高效液相色譜儀:D3000高壓輸液泵,UV2000紫外分光檢測(cè)器)、電子天平 (BS-224S型,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。當(dāng)歸對(duì)照藥材 (批號(hào)9271-9905)、川芎對(duì)照藥材 (批號(hào)0919-200004)、阿魏酸對(duì)照品 (批號(hào)0773-9910)、芍藥苷對(duì)照品 (批號(hào)0736-200014)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?;瘜W(xué)試劑為分析純。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201、110202、110203,自制)。

        2 薄層鑒別

        2.1 當(dāng)歸、川芎的薄層色譜鑒別[2]取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品10粒,研細(xì),取粉末2 g至燒杯中,加水10 mL溶解,加乙醇40 mL,邊加邊攪拌,傾溶液至蒸發(fā)皿中,置水浴上蒸去乙醇至約10 mL,移至分液漏斗中,用少量水洗滌蒸發(fā)皿,洗滌液倒入分液漏斗中,用乙醚振搖提取2次,每次15 mL,合并乙醚提取液,再向上述乙醚溶液中加2%碳酸鈉溶液振搖提取2次,每次15 mL,棄去乙醚液,提取液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2~3,用少量苯洗滌,棄去苯液,再用乙醚振搖提取2次,每次30 mL,合并乙醚提取液,揮干,殘?jiān)右掖? mL溶解,作為供試品溶液。另取當(dāng)歸和川芎對(duì)照藥材各1 g,分別加水100 mL,煎煮1 h,濾過(guò),濾液濃縮至約10 mL,分別加乙醚振搖提取2次,每次15 mL,合并乙醚提取液,揮去乙醚,殘?jiān)右掖? mL使溶解,分別制成當(dāng)歸和川芎的對(duì)照藥材溶液。另取阿魏酸對(duì)照品,加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn),吸取上述各溶液各10 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以苯-冰醋酸-甲醇 (30∶1∶3)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對(duì)照無(wú)干擾,見(jiàn)圖1。

        2.2 白芍的薄層色譜鑒別[3]取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品10粒,研細(xì),取粉末2 g,加水20 mL加熱溶解,置分液漏斗中,用水飽和的正丁醇提取2次,每次30 mL,合并正丁醇液,用水洗滌萃取液2次,每次20 mL。正丁醇液置水浴上濃縮至約1 mL,加中性氧化鋁0.5 g,拌勻,干燥,裝入中性氧化鋁柱 (100~200目,約1 g,內(nèi)徑1~1.5 cm)上,以乙酸乙酯-甲醇 (1∶1)30 mL洗脫,收集洗脫液,蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,作為供試品溶液。另取白芍對(duì)照藥材的粉末1 g,加乙醇15 mL,振搖5 min,濾過(guò),濾液蒸干,殘?jiān)右掖? mL使溶解,制成白芍的對(duì)照藥材溶液。另取芍藥苷對(duì)照品,加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤI B)試驗(yàn),吸取上述供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸 (10∶4∶6∶0.8)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,晾干,噴5%香草醛硫酸溶液,熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn),陰性對(duì)照液色譜中無(wú)干擾,見(jiàn)圖2。

        圖1 當(dāng)歸、川芎 (阿魏酸)的TLC色譜圖

        3 HPLC測(cè)定當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中阿魏酸

        3.1 色譜條件[4-7]Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液 (5∶1∶10);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm;進(jìn)樣量10 μL;阿魏酸出峰時(shí)間為20 min;理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

        圖2 白芍 (芍藥苷)的TLC色譜圖

        3.2 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液,即得。

        3.3 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào)110201)10粒,研細(xì),取粉末5 g,精密稱定,置分液漏斗中,用20 mL水溶解,加少量氯化鈉,用二氯甲烷提取4次 (每次20 mL),合并二氯甲烷層,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮干并回收二氯甲烷,殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中,作為供試品溶液。

        3.4 陰性樣品溶液的制備 按當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊處方和制法,制成缺當(dāng)歸和白芍陰性制劑,精密稱取5 g,再按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。進(jìn)樣20 μL測(cè)定,結(jié)果表明陰性樣品對(duì)阿魏酸測(cè)定無(wú)干擾,見(jiàn)圖3。

        圖3 阿魏酸對(duì)照品 (A)、供試品 (B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

        3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取阿魏酸對(duì)照品7.68 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋到刻度,作為貯備液 (0.307 2 mg/mL)。精密量取貯備液0.5、1、2、4、8 mL置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋到刻度,分別精密吸取20 μL,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定。以阿魏酸的峰面積值為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得出回歸方程為:Y=5×107X,r=1,標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過(guò)原點(diǎn)的一條直線,所以可以用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定計(jì)算阿魏酸。結(jié)果表明阿魏酸在0.015 4~0.245 8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

        3.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為51.2 μg/mL)及同一供試品樣品 (批號(hào)110201)溶液各重復(fù)進(jìn)樣5次,每次20 μL,觀察其重復(fù)性。結(jié)果表明,對(duì)照品溶液阿魏酸峰面積的RSD為1.52%,供試品阿魏酸峰面積的RSD為0.93%,表明本法精密度好。

        3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8 h精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為51.2 μg/mL)及供試品溶液(批號(hào)110201)各20 μL注入液相色譜儀測(cè)定,對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.429%,供試品溶液峰面積的RSD為0.619%。結(jié)果表明,對(duì)照品及供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

        3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201)5份,分別精密稱定,按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液,另取阿魏酸對(duì)照品適量,加甲醇制成1 mL含阿魏酸對(duì)照品0.048 mg的對(duì)照品溶液。

        精密吸取供試品、對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀,以甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液 (5∶1∶10)為流動(dòng)相,測(cè)定,計(jì)算供試品溶液的RSD為1.83%,結(jié)果表明,方法重現(xiàn)性良好。

        3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊試制樣品3批 (批號(hào):110201、110202、110203),各3份,約0.5 g,精密稱定,分別按其含有量的80%、100%、120%加入阿魏酸對(duì)照品適量,按供試品溶液的制備方法,制成供試品溶液,依法測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.10%,RSD為1.37%。見(jiàn)表1。

        表1 阿魏酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

        3.10 樣品測(cè)定 精密稱取3批當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào):110201、110202、110203,每批制成3份供試品)各5 g,按供試品溶液的制備方法,制成供試品溶液,分別按3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 樣品中阿魏酸測(cè)定結(jié)果 (n=3)

        根據(jù)測(cè)定結(jié)果,每1 g樣品中阿魏酸量最高為:0.346 2 mg,最低為:0.304 2 mg,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.324 1 mg/g,結(jié)合廠方工藝提取率以及藥材質(zhì)量的差異,故本制劑阿魏酸含有量暫定為:每1 g樣品含阿魏酸 (C10H10O4)不得少于0.300 0 mg。

        4 HPLC測(cè)定當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中芍藥苷

        4.1 色譜條件[8-11]Kromasil-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水 (18∶82);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;進(jìn)樣量10 μL;芍藥苷出峰時(shí)間為23 min;理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

        4.2 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液,即得。

        4.3 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào)110201)10粒,研細(xì),取粉末5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,密塞稱定質(zhì)量。超聲處理25 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。

        4.4 陰性樣品溶液的制備 按當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊處方和制法,制成缺白芍陰性制劑,精密稱取5 g,再按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。進(jìn)樣10 μL測(cè)定,結(jié)果表明陰性樣品對(duì)芍藥苷測(cè)定無(wú)干擾,見(jiàn)圖4。

        4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取芍藥苷對(duì)照品8.02 mg,置20 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋到刻度,作為貯備液 (0.401 mg/mL)。精密量取貯備液0.5、1、2、4、8 mL置10 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋到刻度,分別精密吸取20 μL,注入液相色譜儀,按上述色譜條件測(cè)定。以芍藥苷的峰面積值為縱坐標(biāo),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得出回歸方程為:Y=2×107X,r=0.999 8,標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過(guò)原點(diǎn)的一條直線,所以可以用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定計(jì)算芍藥苷的量。結(jié)果表明芍藥苷在0.020 05~0.320 8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

        圖4 芍藥苷對(duì)照品 (A)、供試品 (B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

        4.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為40.1 μg/mL)及同一供樣品 (批號(hào)110201)溶液各重復(fù)進(jìn)樣5次,每次20 μL,觀察其重復(fù)性。結(jié)果表明,對(duì)照品溶液芍藥苷峰面積的RSD為1.28%,供試品芍藥苷峰面積的RSD為1.53%,表明儀器精密度好。

        4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8 h精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為40.1 μg/mL)及供試品溶液(批號(hào)110201)各20 μL注入液相色譜儀測(cè)定,對(duì)照品溶液峰面積的RSD為1.68%,供試品溶液峰面積的RSD為1.75%。結(jié)果表明,對(duì)照品及供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

        4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201)5份,分別精密稱定,按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液,另取芍藥苷對(duì)照品適量,加甲醇制成1 mL含芍藥苷對(duì)照品40 μg的對(duì)照品溶液。

        精密吸取供試品、對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀,測(cè)定,計(jì)算供試品中芍藥苷的量,其RSD為1.95%,結(jié)果表明,本法方法重復(fù)性良好。

        4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊試制樣品3批 (批號(hào):110201、110202、110203),各3份,約2.5 g,精密稱定,分別按其含有量的80%、100%、120%加入芍藥苷對(duì)照品適量,按供試品溶液的制備方法,制成供試品溶液,依法測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.05%,RSD為1.02%。見(jiàn)表3。

        表3 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

        4.10 樣品測(cè)定 精密稱取3批當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào):110201、110202、110203,每批制成3份供試品)各5 g,按供試品溶液的制備方法,制成供試品溶液,分別按3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 樣品芍藥苷測(cè)定結(jié)果 (n=3)

        根據(jù)測(cè)定結(jié)果,每1 g樣品中芍藥苷量最高為0.122 8 mg,最低為0.120 5 mg,平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.121 4 mg/g,結(jié)合廠方工藝提取率以及藥材質(zhì)量的差異,故本制劑芍藥苷含有量暫定為每1 g樣品含芍藥苷不得少于0.120 0 mg。

        5 討論

        經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn),通過(guò)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方法和展開(kāi)劑,對(duì)當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中當(dāng)歸、川芎、白芍進(jìn)行TLC鑒別,其色譜特征斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng),所以此3味中藥可用于該制劑的定性鑒別。川芎、當(dāng)歸均有活血調(diào)經(jīng)、化瘀止痛的功效,其有效成分均為阿魏酸[12]、芍藥苷,對(duì)婦女月經(jīng)不調(diào)有很強(qiáng)的藥理作用,所以阿魏酸、芍藥苷可以作為該制劑的指標(biāo)性成分。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊每1 g樣品中阿魏酸不得低于0.300 0 mg/g和芍藥苷不得低于0.120 0 mg,以此作為該制劑定量測(cè)定指標(biāo)。

        實(shí)驗(yàn)選用甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液作流動(dòng)相,增加甲醇量可改變峰形,減少拖尾,但甲醇比例過(guò)高,分離效果下降,不易與雜質(zhì)峰分離。另外加入1%冰乙酸主要是調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH,縮短分離時(shí)間,改善分離度。

        [1]國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:893.

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