謝仲德， 方應(yīng)權(quán)， 李文烈， 夏天水

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶萬(wàn)州 404020;2.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北石家莊 050035;3.成都倍特藥業(yè)有限公司，四川成都 610041)

當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊是由當(dāng)歸、熟地黃、川芎、黨參、白芍、甘草和黃芪組成的復(fù)方制劑。具有補(bǔ)血助氣，調(diào)經(jīng)功效，用于貧血衰弱，病后、產(chǎn)后血虛以及月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)［1］。是在原當(dāng)歸調(diào)經(jīng)顆粒［已收載于《部頒中藥成方制劑》第10冊(cè) (WS3-B-1925-95)］的基礎(chǔ)上進(jìn)行工藝改良而制備的新制劑，具有療效好、服用劑量小的特點(diǎn)。采用薄層色譜法對(duì)制劑中的當(dāng)歸、川芎、白芍進(jìn)行了定性鑒別研究，采用高效液相色譜法建立阿魏酸、芍藥苷的定量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計(jì) (島津UV-3150)、恒溫水浴鍋 (余姚精益溫度儀表廠)、硅膠G(青島海洋化工有限公司)、高效液相色譜法儀 (北京創(chuàng)新通恒科技有限公司高效液相色譜儀:D3000高壓輸液泵，UV2000紫外分光檢測(cè)器)、電子天平 (BS-224S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。當(dāng)歸對(duì)照藥材 (批號(hào)9271-9905)、川芎對(duì)照藥材 (批號(hào)0919-200004)、阿魏酸對(duì)照品 (批號(hào)0773-9910)、芍藥苷對(duì)照品 (批號(hào)0736-200014)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；瘜W(xué)試劑為分析純。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201、110202、110203，自制)。

2 薄層鑒別

2.1 當(dāng)歸、川芎的薄層色譜鑒別［2］取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品10粒，研細(xì)，取粉末2 g至燒杯中，加水10 mL溶解，加乙醇40 mL，邊加邊攪拌，傾溶液至蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸去乙醇至約10 mL，移至分液漏斗中，用少量水洗滌蒸發(fā)皿，洗滌液倒入分液漏斗中，用乙醚振搖提取2次，每次15 mL，合并乙醚提取液，再向上述乙醚溶液中加2%碳酸鈉溶液振搖提取2次，每次15 mL，棄去乙醚液，提取液用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，用少量苯洗滌，棄去苯液，再用乙醚振搖提取2次，每次30 mL，合并乙醚提取液，揮干，殘?jiān)右掖? mL溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸和川芎對(duì)照藥材各1 g，分別加水100 mL，煎煮1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至約10 mL，分別加乙醚振搖提取2次，每次15 mL，合并乙醚提取液，揮去乙醚，殘?jiān)右掖? mL使溶解，分別制成當(dāng)歸和川芎的對(duì)照藥材溶液。另取阿魏酸對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述各溶液各10 μL分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-冰醋酸-甲醇 (30∶1∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈 (365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.2 白芍的薄層色譜鑒別［3］取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品10粒，研細(xì)，取粉末2 g，加水20 mL加熱溶解，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，用水洗滌萃取液2次，每次20 mL。正丁醇液置水浴上濃縮至約1 mL，加中性氧化鋁0.5 g，拌勻，干燥，裝入中性氧化鋁柱 (100～200目，約1 g，內(nèi)徑1～1.5 cm)上，以乙酸乙酯-甲醇 (1∶1)30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對(duì)照藥材的粉末1 g，加乙醇15 mL，振搖5 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，制成白芍的對(duì)照藥材溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (中國(guó)藥典2010年版一部附錄ⅤI B)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸 (10∶4∶6∶0.8)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴5%香草醛硫酸溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照液色譜中無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖1 當(dāng)歸、川芎 (阿魏酸)的TLC色譜圖

3 HPLC測(cè)定當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中阿魏酸

3.1 色譜條件［4-7］Kromasil-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液 (5∶1∶10);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm;進(jìn)樣量10 μL;阿魏酸出峰時(shí)間為20 min;理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

圖2 白芍 (芍藥苷)的TLC色譜圖

3.2 對(duì)照品溶液的制備 取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào)110201)10粒，研細(xì)，取粉末5 g，精密稱定，置分液漏斗中，用20 mL水溶解，加少量氯化鈉，用二氯甲烷提取4次 (每次20 mL)，合并二氯甲烷層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器揮干并回收二氯甲烷，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL量瓶中，作為供試品溶液。

3.4 陰性樣品溶液的制備 按當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊處方和制法，制成缺當(dāng)歸和白芍陰性制劑，精密稱取5 g，再按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。進(jìn)樣20 μL測(cè)定，結(jié)果表明陰性樣品對(duì)阿魏酸測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 阿魏酸對(duì)照品 (A)、供試品 (B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取阿魏酸對(duì)照品7.68 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，作為貯備液 (0.307 2 mg/mL)。精密量取貯備液0.5、1、2、4、8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定。以阿魏酸的峰面積值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程為:Y=5×107X，r=1，標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過(guò)原點(diǎn)的一條直線，所以可以用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定計(jì)算阿魏酸。結(jié)果表明阿魏酸在0.015 4～0.245 8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為51.2 μg/mL)及同一供試品樣品 (批號(hào)110201)溶液各重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，觀察其重復(fù)性。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液阿魏酸峰面積的RSD為1.52%，供試品阿魏酸峰面積的RSD為0.93%，表明本法精密度好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8 h精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為51.2 μg/mL)及供試品溶液(批號(hào)110201)各20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為0.429%，供試品溶液峰面積的RSD為0.619%。結(jié)果表明，對(duì)照品及供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201)5份，分別精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，另取阿魏酸對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mL含阿魏酸對(duì)照品0.048 mg的對(duì)照品溶液。

精密吸取供試品、對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，以甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液 (5∶1∶10)為流動(dòng)相，測(cè)定，計(jì)算供試品溶液的RSD為1.83%，結(jié)果表明，方法重現(xiàn)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊試制樣品3批 (批號(hào):110201、110202、110203)，各3份，約0.5 g，精密稱定，分別按其含有量的80%、100%、120%加入阿魏酸對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.10%，RSD為1.37%。見(jiàn)表1。

表1 阿魏酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.10 樣品測(cè)定 精密稱取3批當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào):110201、110202、110203，每批制成3份供試品)各5 g，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，分別按3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中阿魏酸測(cè)定結(jié)果 (n=3)

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，每1 g樣品中阿魏酸量最高為:0.346 2 mg，最低為:0.304 2 mg，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.324 1 mg/g，結(jié)合廠方工藝提取率以及藥材質(zhì)量的差異，故本制劑阿魏酸含有量暫定為:每1 g樣品含阿魏酸 (C10H10O4)不得少于0.300 0 mg。

4 HPLC測(cè)定當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中芍藥苷

4.1 色譜條件［8-11］Kromasil-C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈-水 (18∶82);體積流量1.0 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;進(jìn)樣量10 μL;芍藥苷出峰時(shí)間為23 min;理論板數(shù)按阿魏酸計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

4.2 對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得。

4.3 供試品溶液的制備 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào)110201)10粒，研細(xì)，取粉末5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞稱定質(zhì)量。超聲處理25 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

4.4 陰性樣品溶液的制備 按當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊處方和制法，制成缺白芍陰性制劑，精密稱取5 g，再按供試品溶液制備方法制備陰性溶液。進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果表明陰性樣品對(duì)芍藥苷測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 精密稱取芍藥苷對(duì)照品8.02 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，作為貯備液 (0.401 mg/mL)。精密量取貯備液0.5、1、2、4、8 mL置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋到刻度，分別精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定。以芍藥苷的峰面積值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出回歸方程為:Y=2×107X，r=0.999 8，標(biāo)準(zhǔn)曲線為通過(guò)原點(diǎn)的一條直線，所以可以用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定計(jì)算芍藥苷的量。結(jié)果表明芍藥苷在0.020 05～0.320 8 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖4 芍藥苷對(duì)照品 (A)、供試品 (B)及陰性樣品 (C)的HPLC色譜圖

4.6 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為40.1 μg/mL)及同一供樣品 (批號(hào)110201)溶液各重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，觀察其重復(fù)性。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液芍藥苷峰面積的RSD為1.28%，供試品芍藥苷峰面積的RSD為1.53%，表明儀器精密度好。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8 h精密吸取芍藥苷對(duì)照品溶液 (質(zhì)量濃度為40.1 μg/mL)及供試品溶液(批號(hào)110201)各20 μL注入液相色譜儀測(cè)定，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為1.68%，供試品溶液峰面積的RSD為1.75%。結(jié)果表明，對(duì)照品及供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊 (批號(hào)110201)5份，分別精密稱定，按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，另取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mL含芍藥苷對(duì)照品40 μg的對(duì)照品溶液。

精密吸取供試品、對(duì)照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算供試品中芍藥苷的量，其RSD為1.95%，結(jié)果表明，本法方法重復(fù)性良好。

4.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定的當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊試制樣品3批 (批號(hào):110201、110202、110203)，各3份，約2.5 g，精密稱定，分別按其含有量的80%、100%、120%加入芍藥苷對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.05%，RSD為1.02%。見(jiàn)表3。

表3 芍藥苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

4.10 樣品測(cè)定 精密稱取3批當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊樣品 (批號(hào):110201、110202、110203，每批制成3份供試品)各5 g，按供試品溶液的制備方法，制成供試品溶液，分別按3.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品芍藥苷測(cè)定結(jié)果 (n=3)

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，每1 g樣品中芍藥苷量最高為0.122 8 mg，最低為0.120 5 mg，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.121 4 mg/g，結(jié)合廠方工藝提取率以及藥材質(zhì)量的差異，故本制劑芍藥苷含有量暫定為每1 g樣品含芍藥苷不得少于0.120 0 mg。

5 討論

經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方法和展開(kāi)劑，對(duì)當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊中當(dāng)歸、川芎、白芍進(jìn)行TLC鑒別，其色譜特征斑點(diǎn)清晰、專屬性強(qiáng)，所以此3味中藥可用于該制劑的定性鑒別。川芎、當(dāng)歸均有活血調(diào)經(jīng)、化瘀止痛的功效，其有效成分均為阿魏酸［12］、芍藥苷，對(duì)婦女月經(jīng)不調(diào)有很強(qiáng)的藥理作用，所以阿魏酸、芍藥苷可以作為該制劑的指標(biāo)性成分。當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊每1 g樣品中阿魏酸不得低于0.300 0 mg/g和芍藥苷不得低于0.120 0 mg，以此作為該制劑定量測(cè)定指標(biāo)。

實(shí)驗(yàn)選用甲醇-乙腈-1%冰乙酸溶液作流動(dòng)相，增加甲醇量可改變峰形，減少拖尾，但甲醇比例過(guò)高，分離效果下降，不易與雜質(zhì)峰分離。另外加入1%冰乙酸主要是調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，縮短分離時(shí)間，改善分離度。

［1］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999:893.

［2］姚慧娟，胡道德，顧 磊，等.靈杞黃斑膠囊的薄層鑒別研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(11):2795-2796。

［3］黃艷萍，黃勇紅.當(dāng)歸調(diào)經(jīng)片的薄層鑒別和阿魏酸的測(cè)定［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(6):119-121.

［4］葉會(huì)呈，葉期馨，王帶媚，等.HPLC法測(cè)定血府逐瘀湯中阿魏酸的含量［J］.中國(guó)新藥與臨床藥理，2009，20(4):356-358.

［5］王 健，范文成，葉曉紅，等.HPLC法測(cè)定婦康片中阿魏酸的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14(8):15-16.

［6］彭 紅，付建武，余日躍.復(fù)方當(dāng)歸注射液中羥基紅花黃色素A和阿魏酸的含量測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20(12):2925-2927.

［7］譚曉虹，郭春燕，李 倩，等.桃紅四物湯水提液中沒(méi)食子酸、芍藥苷和紅花黃色素含量的測(cè)定［J］.中成藥，2008，30(7):9945-997.

［8］毛曉敏，張小波，陳小清，等.HPLC同時(shí)測(cè)定十二烏雞白鳳丸中芍藥苷、阿魏酸和丹皮酚的含量［J］.中成藥，2008，30(5):678-681.

［9］凌 明，馬安宇.HPLC測(cè)定胃腸合劑中芍藥苷和黃芩苷的含量［J］.中成藥，2008，30(9):1311-1313.

［10］賀志偉，賀 慶，林云徑，等.RP-HPLC法測(cè)定杭白芍及其飲片中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷［J］.中草藥，2008，39(3):378-380.

［11］張葉萍，黃琴偉，龔 青，等.HPLC測(cè)定升血膏中芍藥苷的含量［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33(2):200-201.

［12］呂光華，程世瓊，陳金泉，等.HPLC測(cè)定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)［J］.中國(guó)中藥雜志，2010，35(2):194-197.