何海洋， 王洪新*， 張 晶， 喻曉春

(1.遼寧省心腦血管藥物基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州 121001;2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

心肌肥厚是心臟對急、慢性血流動力學(xué)超負(fù)荷的一種基本的適應(yīng)性反應(yīng)，長期的心肌肥厚可引起心血管疾病發(fā)生率及死亡率增高［1］。由于心肌組織長期受到壓力負(fù)荷的刺激，機(jī)體通過多種調(diào)節(jié)方式使心臟產(chǎn)生各種分泌因子，使心臟能夠適應(yīng)這種刺激。Toll樣受體-4(TLR-4)是連接先天免疫和特異性免疫的跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，在心臟中也有較高水平的表達(dá)，可以介導(dǎo)多種內(nèi)源性的刺激反應(yīng)。例如大分子的降解產(chǎn)物、蛋白水解產(chǎn)物、細(xì)胞破裂后釋放的細(xì)胞內(nèi)成分以及炎癥活化的基因產(chǎn)物等［2］，細(xì)菌脂多糖 (LPS)就是其內(nèi)源性配體之一［3］。NF-κB是許多促炎因子黏附分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與許多炎癥等病理過程。在心肌組織中，NF-κB可被多種引起心肌肥厚的刺激因子活化引起心肌細(xì)胞肥大，它的過表達(dá)還可啟動心房利鈉肽 (ANP)、腦鈉肽 (BNP)的表達(dá)［4］。NF-κB 還可以與MAPK等其他導(dǎo)致肥厚的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間交互作用，共同促進(jìn)肥厚的發(fā)生發(fā)展［5］。研究證實(shí) TLR-4的活化可以激活 NF-κB，相反 NF-κB基礎(chǔ)水平的表達(dá)也是維持 TLR-4的表達(dá)所必須的［6］。因此認(rèn)為 TLR-4/NF-κB信號通路是引起心肌肥厚的重要通路之一。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)黃芪甲苷具有抑制大鼠心肌肥厚的作用［7］，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)黃芪甲苷可以抑制由LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大［8］，因此本研究著重探討在體條件下，黃芪甲苷是否通過TLR-4/NF-κB信號通路來抑制心肌肥厚，進(jìn)一步闡述黃芪甲苷抑制心肌肥厚的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 Spargue-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，2月齡，體質(zhì)量220～250 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)20030007。

1.2 藥品、試劑和儀器 黃芪甲苷原料藥 (純度大于98%，成都曼斯特生物科技有限公司)，辛伐他丁原料藥 (SIGMA)，TNF-α和 IL-1β ELISA試劑盒 (R＆D公司)，Trizol、ANP mRNA試劑盒、(大連寶生物 Takara公司)、p2I κ B2 α多克隆抗體 (Santa Cruz公司)、1∶100、I κ B2 α 多克隆抗體及1∶100、GAPDH多克隆抗體 (武漢博士德公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢博士德公司)，細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒 (碧云天公司)，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。Carl Zeiss生物顯微鏡 (德國)。TGL—16G低溫高速離心機(jī) (日本日立公司)，梯度PCR分析儀 (英國TECHNE公司，型號:TC—512)，改良的Langendorff心臟灌流裝置 (國產(chǎn))。

1.3 動物模型制備和分組給藥 分組方法:SD大鼠220～250 g(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)40只，隨機(jī)分為5組，每組8只。分別是假手術(shù)組、心肌肥厚模型組 (模型組)、黃芪甲苷低劑量組［40 mg/(kg·d)］、黃芪甲苷高劑量組［80 mg/(kg·d)］、辛伐他丁組［40 mg/(kg·d)］。術(shù)后1周灌喂給藥，假手術(shù)組、心肌肥厚模型組給予蒸餾水，至12周麻醉處死，進(jìn)行指標(biāo)檢測。

所有心肌肥厚模型均采用腹主動脈縮窄術(shù)造模。手術(shù)方法參見已有文獻(xiàn) ［7］。假手術(shù)組處理同上，但不進(jìn)行結(jié)扎。

1.4 HMI和LVMI測定 全心質(zhì)量指數(shù) (heart mass index，HMI)=全心質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量(g)、左心室質(zhì)量指數(shù) (leftventricular mass index，LVMI)=左心室質(zhì)量 (mg)/體質(zhì)量 (g)，以此反映心肌肥厚的程度。麻醉后開胸取心，將取出心臟立即置入4℃的KB液漂洗 (95%O2～5%CO2飽和)，清洗后于冰浴培養(yǎng)皿中，剔除非心肌組織，用濾紙吸干多余水分，置分析天平上稱全心質(zhì)量，再迅速剪去右心室游離壁，取左室及室間隔稱左心質(zhì)量，進(jìn)行計(jì)算。

1.5 組織學(xué)觀察 橫向截取心尖部位 (包括室間隔)約0.5 cm，置10%中性甲醛緩沖液固定，24 h后行石蠟包埋、切片 (5 μm)、常規(guī)HE染色后置顯微鏡下，測量心肌細(xì)胞橫徑，計(jì)算平均值，測量時采用單盲法進(jìn)行，每組選取20個細(xì)胞。參照已有文獻(xiàn)進(jìn)行［9］。

1.6 ELISA法檢測血清中TNF-α和 IL-1β水平 按照說明書操作，取出96孔反應(yīng)板，分別加入50 μL標(biāo)本 (或?qū)φ找夯驑?biāo)準(zhǔn)品)于反應(yīng)孔里，吸取10 μL(TNF-α或IL-1β)抗體至反應(yīng)孔里，室溫下孵育1 h，吸出液體，洗板3次，加50 μL顯色液，室溫孵育15 min，每孔加入50 μL終止液。全自動酶標(biāo)儀在450 nm波長讀取吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各標(biāo)本吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的濃度。

1.7 RT-PCR法測量左心室心肌 ANP mRNA及TLR-4 mRNA的表達(dá) 根據(jù)已有文獻(xiàn)進(jìn)行操作［7］。取約100 mg鼠心臟組織放于玻璃研磨器內(nèi)。取約1 μg總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄條件為42℃60 min，99℃ 2 min，4℃保存。ANP的引物序列(5'-3')為GGC TCC TTC TCC ATC ACC AA TGT TAT CTT CGG TAC CG［8］，內(nèi)參 GAPDH的引物序列(5'-3')為CAA AGT TGT CAT GGA TGA CCA TGG AGA AGG CTG GG。上述引物由北京奧科生物有限公司合成，滅菌水溶解并配制成100 μmol/L的上下游引物混合液，使用濃度為 20 μmol/L。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 4 min，變性94℃ 45 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 45 s，終末延伸72℃ 5 min，4℃終止，20循環(huán)。TLR-4引物序列為5'-GGGTGAGAAACGAGCT-3';內(nèi)參GAPDH的引物序列為5'-CATCACCATCTTCCAGGAGC-3';反轉(zhuǎn)錄5'-GGATGATGTTCTGGGCTGCC-3'。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，然后進(jìn)行30個循環(huán)，94℃ 30 s，60℃ 60 s，72℃ 1.5 min，最后72℃10 min。循環(huán)擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和分析。

1.8 Western bolotting檢測大鼠左心室組織中NF-κB蛋白的表達(dá) 勻漿左心室心肌組織100 mg，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒的操作說明提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，將各組蛋白濃度調(diào)成一致，沸水煮5 min待用。各組取樣品30 μg，以樣品中的GAPDH為內(nèi)參，經(jīng)SDS2PA GE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，然后用含5%脫脂奶粉PBS封閉2 h，分別加入適量含2%脫脂奶粉PBS稀釋的兔抗大鼠 p2I κ B2 α 多克隆抗體 1 ∶100、I κ B2 α多克隆抗體1∶100、GAPDH多克隆抗體1∶200、4℃孵育過夜 ，PBS洗膜3次 ，10 min/次，再分別加入適量含2%脫脂奶粉，PBS稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 1∶5 000室溫下作用2 h，PBS洗膜3次，10 min/次ECL化學(xué)發(fā)光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存用 Gel2Pro Analyzer(Ver 1 310)軟件測定蛋白條帶灰度值，以 p2I κ B2 α與 I κ B2 α條帶灰度值與內(nèi)參β-action條帶灰度值的比值將p2I κ B2 α 與 I κ B2 α 表達(dá)量化。利用圖像分析軟件讀取各組NF-κB和的蛋白印跡密度值，用各組NF-κB/β-action 的值來比較 NF-κB 表達(dá)的強(qiáng)弱。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用單因素方差One-Way ANOVA分析，方差齊采用LSD進(jìn)行多重比較。方差不齊采用Dunnett'sT3法進(jìn)行多重比較。P＜0.05認(rèn)為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為有顯著性差異，P＞0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HMI和LVMI測定結(jié)果 模型組的HMI和LVMI值顯著高于假手術(shù)組 (P＜0.01)，表明該組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)以左心室肥厚為特征的心肌肥厚。黃芪甲苷高劑量組與辛伐他丁組的HMI和LVMI值低于模型組(P＜0.05);黃芪甲苷低劑量組的HMI和LVMI值雖低于模型組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，說明高劑量黃芪甲苷有抑制心肌肥厚的作用，低劑量黃芪甲苷的治療作用不如高劑量組顯著。詳見表1。

表1 黃芪甲苷對心肌肥厚大鼠HMI和LVMI的影響(±s)Tab.1 Influence of astragaloside IV on HMI and LVMI in rats model of myocardial hypertrophy(±s)

表1 黃芪甲苷對心肌肥厚大鼠HMI和LVMI的影響(±s)Tab.1 Influence of astragaloside IV on HMI and LVMI in rats model of myocardial hypertrophy(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

分 組 HMI/(mg·g－1) LVMI/(mg·g－1)假手術(shù)組2.83±0.16 1.62±0.10模型組 3.42±0.21＊＊ 2.41±0.17＊＊黃芪甲苷低劑量組 3.31±0.28＊＊ 2.31±0.15＊＊黃芪甲苷高劑量組 3.08±0.31*# 2.17±0.19*#辛伐他丁組 2.96±0.29## 2.19±0.16##

2.2 組織學(xué)觀察 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞橫徑均值為 (26.45±2.27)μm，模型組大鼠心肌細(xì)胞橫徑增加至 (34.15±2.17)μm，增加了29.11%(P＜0.01)，說明模型組大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生明顯肥大。黃芪甲苷低劑量組大鼠心肌細(xì)胞橫徑為(32.58±2.09)μm，黃芪甲苷高劑量組細(xì)胞橫徑為 (28.32±2.56)μm，與模型組相比減小了17.07% (P＜0.05)。辛伐他丁組細(xì)胞橫徑為(29.67±2.87)μm。見圖1，圖2。

2.3 血清中TNF-α和IL-1β的水平檢測結(jié)果 通過表2可以看出，發(fā)生心肌肥厚的大鼠 (模型組)血清中的TNF-α和IL-1β的水平明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，說明心肌肥厚的形成伴有炎癥因子的激活。高劑量黃芪甲苷和辛伐他丁具有降低心肌肥厚的大鼠血清中的 TNF-α和 IL-1β水平作用(P＜0.05)，低劑量黃芪甲苷有一定的治療作用，但沒有高劑量組顯著。

圖1 心肌肥厚大鼠左心室細(xì)胞冠狀面HE染色切片F(xiàn)ig.1 Coronal plane from left ventricular tissue in rats model of myocardial hypertrophy(HE×200)

圖2 各組心肌細(xì)胞橫徑柱狀圖 (±s)Fig.2 Bar graph of the trans diameter of left ventricular cells diameter in rats model of myocardial hypertrophy

表2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平Tab.2 Content of TNF-α and IL-1β in serum of myocardial hypertrophy of rats(±s)

表2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平Tab.2 Content of TNF-α and IL-1β in serum of myocardial hypertrophy of rats(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

分 組 TNF-ɑ/(ng·L－1) IL-1β/(pg·L－1)假手術(shù)組45.72±19.43 78.26±13.95模型組 108.85±31.64＊＊ 469.31±45.73＊＊黃芪甲苷低劑量組 98.90±26.17＊＊ 425.19±61.80＊＊黃芪甲苷高劑量組 71.94±18.28*# 115.07±26.46*#辛伐他丁組 64.33±27.54*# 106.28±17.52*#

2.4 左心室組織中ANP mRNA及TLR-4 mRNA的表達(dá) 通過計(jì)算機(jī)凝膠成像系統(tǒng)可以看出，模型組的ANP mRNA反轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的量明顯高于假手術(shù)組 (P＜0.01)，黃芪甲苷高劑量組和辛伐他丁組的ANP mRNA表達(dá)的量小于模型組 (圖3A)。觀察各組TLR-4 mRNA的表達(dá)，模型組的TLR-4 mRNA反轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的量同樣明顯高于假手術(shù)組，黃芪甲苷高劑量組和辛伐他丁組的TLR-4 mRNA表達(dá)的量明顯小于模型組 (圖3B)，各組TLR-4 mRNA表達(dá)該組ANP mRNA的表達(dá)趨勢一致 (表3)。

圖3RT-PCR法檢測大鼠左心室組織ANP(A)與TLR-4(B)mRNA表達(dá)的圖像Fig.3 mRNA levels of ANP(A)and TLR-4(B)from left ventricular tissue in rats by RT-PCR

表3 左心室組織中ANP mRNA及TLR-4 mRNA的表達(dá)Tab.3 mRNA levels of ANP and TLR-4 from left ventricular tissue in rats by RT-PCR(±s)

表3 左心室組織中ANP mRNA及TLR-4 mRNA的表達(dá)Tab.3 mRNA levels of ANP and TLR-4 from left ventricular tissue in rats by RT-PCR(±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組相比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

分 組 (ANP/GAPDH) (TLR-4/GAPDH)假手術(shù)組0.23±0.07 0.18±0.09模型組 1.16±0.19＊＊ 0.97±0.18＊＊黃芪甲苷低劑量組 1.10±0.12＊＊ 0.94±0.16＊＊黃芪甲苷高劑量組 0.76±0.18# 0.56±0.17##辛伐他丁組 0.71±0.20## 0.62±0.14##

2.5 大鼠左心室組織中NF-κB蛋白的表達(dá) 由圖4、圖5可以看出，模型組的IκBα蛋白的表達(dá)最高，而假手術(shù)組最低，兩組蛋白印跡相對密度分別為 (1.05±0.12)和 (0.32±0.09)，模型組的IκBα蛋白表達(dá)遠(yuǎn)高于假手術(shù)組 (P＜0.01)。高劑量黃芪甲苷和辛伐他丁能夠降低肥厚心肌組織中IκBα蛋白的表達(dá)，其蛋白印跡的相對密度分別為(0.77±0.15)和 (0.81±0.17)。黃芪甲苷低劑量組IκBα蛋白印跡相對密度為 (0.98±0.19)，與模型組比較無差異 (P＞0.05)，并且各組的IκBα蛋白表達(dá)的高低與該組ANP mRNA及TLR-4 mRNA表達(dá)的高低一致。

圖4 Western bolotting檢測大鼠左心室組織中NF-κB的蛋白表達(dá)的圖像Fig.4 Protein expression of NF-κB from left ventricular tissue in rats by Western bolotting

圖5 比較大鼠左心室組織中NF-κB的蛋白表達(dá)的柱狀圖 (±s，n=3)Fig.5 Bar graph of the protein expression of NF-κB from left ventricular tissue in rats

3 討論

從全心質(zhì)量指數(shù)、左心室質(zhì)量指數(shù)和細(xì)胞橫徑這些形態(tài)學(xué)指標(biāo)可以看出黃芪甲苷具有抑制心肌肥厚的作用，并且高劑量組的抑制效果更為明顯。ANP是心肌肥大的標(biāo)志性基因之一，ANP mRNA表達(dá)量的大小可以從基因?qū)用鏈?zhǔn)確的反映心室肥厚的程度［9］。從圖3A可以看出黃芪甲苷組的ANP mRNA表達(dá)低于模型組，且高劑量組更為顯著與辛伐他丁組的表達(dá)無差異 (表3)，因此可以認(rèn)為黃芪甲苷具有抑制大鼠心肌肥厚的作用，高劑量的效果與辛伐他丁相當(dāng)。

TLRs普遍存在于多種類型細(xì)胞的胞膜上或胞漿中，可啟動宿主防衛(wèi)反應(yīng)，引發(fā)組織損傷感染以及組織重構(gòu)等生理或病理過程。它在胞漿內(nèi)的結(jié)構(gòu)域與IL-1受體相似，能夠啟動IRAK-TRAF6信號途徑，最終活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB［10］。在機(jī)體受到感染或長期處于應(yīng)激狀態(tài)下，原本在細(xì)胞內(nèi)的一些物質(zhì)會被釋放到細(xì)胞外，并且作為危險信號刺激TLR-4。比如存在于線粒體中的HSP60(熱休克蛋白60)釋出細(xì)胞后可激活 TLR-4，導(dǎo)致黏附因子的表達(dá)和炎癥介質(zhì)的釋放，如IL-1和TNF-α，另外還可以激活 IL-12和 IL-15［11］。在心肌細(xì)胞中，TNF-α和Ang II能增加TLR-4的表達(dá)，而在肥厚心肌中TNF-α和Ang II的水平是明顯高于正常心肌組織的［12］。本研究中模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平顯著升高，左心室組織TLR-4 mRNA高表達(dá)，說明機(jī)械牽張力對心臟的長期刺激，引起了炎癥因子的釋放，活化了TLR-4，并最終引起NF-κB的表達(dá)顯著升高。NF-κB作為心肌肥厚刺激因子的下游靶點(diǎn)，通過誘導(dǎo)炎癥、免疫活性分子的表達(dá)，發(fā)揮防御和免疫調(diào)節(jié)作用，參與心肌肥厚的形成;此外，NF-κB本身的過度表達(dá)也可以造成胚胎基因的表達(dá)和心肌細(xì)胞肥大［13-14］。本研究中，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平顯著升高(表2)，左心組織中TLR-4 mRNA的表達(dá) (圖3B)和NF-κB蛋白的表達(dá) (圖4)也顯著升高，當(dāng)給予黃芪甲苷干預(yù)后，上述指標(biāo)均有下降。表明由炎性因子 (TNF-α 和IL-1β)/TLR-4/NF-κB介導(dǎo)的信號通路參與心肌肥厚的形成，黃芪甲苷的作用機(jī)制與該通路有關(guān)。

需要指出的是，TLR-4的內(nèi)源性配體較多，如黏多糖，GAGs、纖維連接蛋白中的 EDA片段、HSP家族等［15］。經(jīng)TLR-4介導(dǎo)后，活化單核巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子，這些因子可通過MyD88依賴性和非MyD88依賴性兩種途徑激活下游的 NF-κB信號。另外TNF-α還會以旁分泌方式再次作用與TLR-4，形成正反饋［16］。因此，黃芪甲苷是否參與TLR-4上游或NF-κB上游其它的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的調(diào)解還有待深入研究。

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