甘海燕，楊竹青，王自蕊，隗黎麗

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

城市生活污水常常含有大量的有機污染物、細菌和病毒，同時還含有一些寄生蟲卵及化學(xué)有害物質(zhì)[1]。這些物質(zhì)對水生生物具有毒害作用，但其有毒化合物的成分復(fù)雜，且濃度較低，難以全面評價它們對水生生物的毒性效應(yīng)[2]。如將它們作為一個整體來評估其危害則更加可靠[3]。近年來，廢水和水污染物對魚的生物效應(yīng)研究在國內(nèi)外越來越受到重視[4]，因魚類的生理系統(tǒng)具有與哺乳動物類似的特點，水污染物對魚類毒性影響的結(jié)論可以應(yīng)用到其它脊椎動物，也可以據(jù)此預(yù)測、推測污染物對人類健康可能產(chǎn)生的影響。在江蘇省，環(huán)境保護部門已開始嘗試用魚類來監(jiān)控敏感化工項目排水的毒性，并取得了較好的效果[5]。

斑馬魚(Danio rerio)作為模式生物的地位早已在國際上被普遍認可，被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及功能組學(xué)研究。而最近10年來，國內(nèi)外已廣泛運用斑馬魚作為動物模型進行生態(tài)毒理研究。劉在平[6]曾研究過城市污水對斑馬魚仔魚的毒性作用及對斑馬魚胚胎的影響;張青碧[7]開展了城市生活污水對水生動物斑馬魚的發(fā)育毒性的研究;吳玲玲[8]以斑馬魚為研究對象報道了生活污水中菲對斑馬魚鰓和肝臟組織的影響。然而目前還沒有關(guān)于生活污水對魚類細胞因子影響的報道，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是一種重要的多極性細胞轉(zhuǎn)錄核因子，能夠調(diào)控多種與炎癥有關(guān)的細胞因子，參與機體免疫、炎癥和細胞再生、凋亡等過程，其過度活化可引起多種病理生理反應(yīng)[9]。為了更全面地評價生活污水的毒性效應(yīng)，本研究以南昌市鵬鷂污水處理廠(南昌市鵬鷂污水處理廠服務(wù)范圍包括紅谷灘新區(qū)、紅谷灘周邊地區(qū)、鳳凰洲新區(qū)及紅角洲開發(fā)區(qū))泵進的污水作為研究對象，探討其對斑馬魚肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和基因表達的影響，以便為污水處理和管理部門提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

斑馬魚購買于南昌市千花伴花鳥魚市場，體長為2～4 cm，體質(zhì)量為5～10 g，無病無傷，在實驗室暫養(yǎng)一周后用于實驗。生活污水采自南昌市鵬鷂污水處理廠未經(jīng)處理的生活污水，普通定性濾紙去除懸浮物，抽濾后的水樣于4℃保存，然后用于暴露實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗魚處理 將在實驗室暫養(yǎng)1周后的斑馬魚隨機分成4組，每組50尾金魚。第1組為對照組，2、3、4組分別為100%、50%和25%的實驗處理組。試驗用水為曝氣充氧除氯24 h以上的自來水，試驗期間投食，采用自然光照，每24 h更換試驗液1次。分別在暴露后的第4天、7天和14天取斑馬魚的肝臟，每組取3尾魚肝臟投入Bouin氏液中固定制作組織切片，同時每組取5尾魚的肝臟混合，放入液氮中凍存提取RNA用RT-PCR測定NF-κB基因的表達水平的變化。

1.2.2 組織切片的制備 石蠟切片的制作步驟包括取材、固定、洗滌、脫水、透明、包埋、切片、展片、貼片、染色和封片步驟。固定的組織用流水沖洗12～14 h;經(jīng)過70%、80%、85%、95%(2次)、100%(2次)乙醇分別脫水60 min、60 min、60 min、45 min和45 min;經(jīng)二甲苯透明至組織透明狀;選擇熔點為56～60℃的石蠟進行包埋，包埋時組織切口朝下;用切片機切片(厚7 μm);置于45℃的水浴中展片、貼片;貼片后置于37℃恒溫箱內(nèi)烘干;烘干的切片采用蘇木素－伊紅(H·E)法進行染色;染色后晾干，然后用中性樹膠封片。將制作的切片置于LEICA DM 2500生物顯微鏡下觀察，并拍照，讀片。

1.2.3 RT-PCR分析 取出液氮中凍存的肝臟組織，用Trizol(Invitrogen)提取斑馬魚肝臟組織的總RNA，1.2%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。將所提取的RNA樣品，用20 μL DEPC水溶解，用紫外分光光度計測出每個RNA樣品的濃度。取5 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所用試劑盒為RevertAid TM Fisrt Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，操作步驟按其說明書進行。根據(jù)GenBank上公布的斑馬魚的序列，用Primer Premier 5.0軟件進行引物設(shè)計，優(yōu)化退火溫度并擴增得到預(yù)期片段(表1)。

表1 目的基因及內(nèi)參基因的引物Tab.1 Primers of target and internal control genes

采用雙管法，以GAPDH基因為內(nèi)標(biāo)，用斑馬魚肝臟cDNA在同等條件下分別擴增GAPDH和NF-κB。20 μL 反應(yīng)體系中含 1.0 μL cDNA 模板，正反向 PCR 引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，0.5 μL dNTP(10 μmol/L)，2.5 μL 10 × Buffer，0.2 μL ExTaqE(TaKaRa)，加滅菌水補充到20 μL 體系。反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性5 min，相應(yīng)的退火溫度(表1)30 s，72℃ 60 s，相應(yīng)的最佳循環(huán)數(shù)(35，35)，最后72℃延伸5 min。本實驗PCR產(chǎn)物用EB染色，在TAE電泳緩沖液中以15 g/LTAE瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳顯像儀拍照，用Quantity One軟件進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 行為觀察

在染毒實驗期間，對照組和處理組的受試魚均未發(fā)生死亡。與對照組相比，暴露在濃度為25%濃度的污水溶液中，受試魚未發(fā)生明顯的行為異常，但100%濃度暴露下，受試魚的活動減少，少數(shù)魚間歇停留在魚缸底部。

2.2 石蠟切片觀察

2.2.1 斑馬魚對照組肝臟組織 對照組斑馬魚的肝細胞呈多角形，形狀變化不大，胞質(zhì)均勻、清晰，細胞界限清楚，細胞核圓球形或不規(guī)則形，位于中央，核內(nèi)有1個或2個核仁。細胞間的竇狀隙明顯，肝細胞索相互交錯(圖1)。

2.2.2 斑馬魚在污水中暴露4 d后肝臟組織的變化 斑馬魚在25%濃度的生活污水中暴露4 d后，肝竇隙稍有擴張，其他病變不明顯(圖2－A);斑馬魚在50%濃度的生活污水中暴露4 d后，肝細胞輕微腫脹，細胞核偏離中央(圖2－B);斑馬魚在100%濃度的生活污水中暴露4 d后，細胞界限模糊，部分細胞核裂解，出現(xiàn)空泡樣(圖2－C)。

圖1 斑馬魚對照組肝組織結(jié)構(gòu)(H.E，400×)Fig.1 Structure of liver in zebrafish from control(H.E，400 ×)

圖2 斑馬魚肝臟在不同濃度污水中暴露4 d后的變化(H.E，400×)Fig.2 Effects of urban sewage on the liver of zebrafish after exposure for 4 days(H.E，400 ×)

2.2.3 斑馬魚在污水中暴露7 d后肝臟組織的變化 斑馬魚在25%濃度的生活污水中暴露7 d后，細胞質(zhì)模糊，部分細胞核裂解成小碎核(圖3－A);斑馬魚在50%濃度的生活污水濃度暴露7 d后，細胞核偏離中央，排列紊亂，細胞核裂解量增加，空泡樣增多(圖3－B);斑馬魚在100%濃度的生活污水濃度試樣7 d后，肝竇出現(xiàn)淤血，細胞腫大，部分細胞壞死(圖3－C)。

2.2.4 斑馬魚在污水中暴露14 d后肝臟組織的變化 斑馬魚在25%濃度的生活污水濃度暴露14 d后，細胞腫大，細胞核裂解，出現(xiàn)網(wǎng)狀(圖4－A);斑馬魚在50%濃度的生活污水濃度暴露14 d后，肝竇充血，細胞界限模糊(圖4－B);斑馬魚在100%濃度的生活污水濃度暴露14 d后，肝竇充血，部分細胞壞死(圖4－C)。

圖3 斑馬魚肝臟在不同濃度污水中暴露7 d后的變化(H.E，400×)Fig.3 Effects of urban sewage on the liver of zebrafish after exposure for 7 days

圖4 斑馬魚肝臟在不同濃度污水中暴露14天后的變化(H.E，400×)Fig.4 Effects of urban sewage on the liver of zebrafish after exposure for 14 days

2.3 半定量RT-PC R

NF-κB在生活污水處理組和對照組中肝臟中的表達見圖5。由圖5可知，斑馬魚經(jīng)25%、50%、100%濃度生活污水處理4 d、7 d和14 d后，NF-κB的表達相對于對照組明顯上升。對RT-PCR產(chǎn)物采用Quantity One進行灰度分析發(fā)現(xiàn)，在處理7 d后，50%和100%濃度組的NF-κB的表達相對于GAPDH的表達明顯增加，而處理14 d后，這種表達變化更明顯，3個濃度組的NF-κB的表達均顯著增加，分別為2.36 倍、2.67 倍和2.91 倍。

圖5 生活污水對斑馬魚NF-κB表達的影響Fig.5 Expression of NF-κB mRNA in zebra fish after exposed to urban sewage

3 結(jié)論與討論

肝臟是魚類最大的腺體，也是各種物質(zhì)代謝最重要的器官之一。它不僅具有分泌膽汁，合成蛋白質(zhì)，貯存糖原和脂滴的功能，而且能夠中和、分解有毒物質(zhì)。魚的肝臟(或肝胰腺)是極敏感的器官，也是魚類進行物質(zhì)代謝的重要樞紐，外源異生物質(zhì)主要在肝臟中進行生物轉(zhuǎn)化，當(dāng)魚類暴露在受污染的水環(huán)境中一定時間，其肝組織會發(fā)生結(jié)構(gòu)和生理變化[10]。斑馬魚肝臟是環(huán)境監(jiān)測[11]、毒理學(xué)實驗研究的重要器官[12]。一般情況下魚類受到毒物作用后，肝細胞通常會發(fā)生腫大、空泡化和壞死[13]。李莉等[14]將稀有鮈鯽暴露在生活污水中，電鏡觀察肝細胞發(fā)現(xiàn)肝細胞在生活污水的脅迫下細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，無論是長期或是短期、低濃度或高濃度的暴露，細胞核均嚴重變形，核仁擴大，細胞器遭到損壞，脂滴大量出現(xiàn)且增大。本研究的結(jié)果表明斑馬魚暴露在生活污水中，肝臟組織會發(fā)生病變，主要表現(xiàn)在肝竇隙擴張，細胞核腫大甚至裂解消失，胞質(zhì)疏松，空泡明顯增加。這與以往報道的有毒物質(zhì)對魚類肝細胞的毒害以及由于環(huán)境污染而引起的魚類肝細胞組織結(jié)構(gòu)的變化結(jié)果相一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)隨著暴露濃度的增加和暴露時間的延長，斑馬魚肝臟組織損傷更嚴重。

NF-κB是一種能與體內(nèi)多種細胞基因啟動子部位相結(jié)合的核蛋白，可調(diào)節(jié)多種細胞因子和炎性介質(zhì)表達。余海放和聶虎[15]報道百草枯作用血管內(nèi)皮細胞8 h后，就能促使NF-κB明顯活化，促發(fā)和推進炎癥反應(yīng)?；罨腘F-κB可調(diào)控炎性細胞因子在肝臟的分泌，加重肝細胞損傷[16]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚在受到生活污水處理后，NF-κB的表達上調(diào)，并且隨著污水的濃度的增加和處理時間的延長，表達變化更明顯，這與組織切片的結(jié)果相一致。通過以上組織結(jié)構(gòu)和基因表達的分析，直接排放的生活污水中的有毒有害物質(zhì)會對魚類產(chǎn)生毒性效應(yīng)，造成解毒器官肝組織損傷，并可引起NF-κB基因的激活，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。為保護水生生物賴以生存的水環(huán)境并確保人類飲用水的安全，應(yīng)加強對生活污水的管理和控制。

致謝:感謝江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)國家重點實驗室的艾華水老師在切片的顯微拍照中給予的指導(dǎo)，感謝南昌市鵬鷂污水處理廠在采樣中給予的大力支持，感謝水產(chǎn)081班的王元濤、金鑫、劉小鵬等同學(xué)在實驗過程中的大力幫助。

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