肖金華，武艷平 ，陸 偉，劉林秀，霍俊宏，季華員，康昭風(fēng)，謝明貴，唐維國，何余湧，侯冠彧，謝金防

(1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/江西省高等學(xué)校動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045;3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品質(zhì)資源研究所，海南 儋州 571737)

崇仁麻雞是江西省優(yōu)良地方雞種，蛋肉兼用型，肉嫩味美，營養(yǎng)豐富，具有顯著的“三高一低”特點(diǎn)，即“可食部分高，人體必須的八種氨基酸含量高，維生素含量高，膽固醇含量低微?！睆倪z傳角度來看，它是我國最寶貴的優(yōu)質(zhì)型青腳麻雞遺傳資源。但是崇仁麻雞生長速度較慢，飼料轉(zhuǎn)化率低，這嚴(yán)重的制約了它的發(fā)展。

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PepT1)是一種主要針對二肽，三肽等小肽進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白，它對底物具有廣泛的適應(yīng)性[1]。目前，在動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括PepT1、PepT2、PTR3、大鼠的肽/組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PHT1)和人的肽/組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(hPHT)[2]。其中研究最廣泛的是PepT1和PepT2。PepT1主要是腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它是一類低親和力、高容量的肽載體;PepT2主要是腎臟肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，它是一類高親和力、低容量的肽載體。1994年，F(xiàn)ei等[3]成功的克隆了寡肽的I型載體。小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)是動物組織內(nèi)一個重要的生理過程[4]。小腸對小肽(主要是一肽和二肽)的吸收是通過位于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜的H+耦合的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體(PepT1)進(jìn)行的[5]，而質(zhì)子是作為肽轉(zhuǎn)運(yùn)的驅(qū)動力發(fā)揮作用的[6]。與游離氨基酸吸收相比，小肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低、不易飽和的特點(diǎn)[7]，而游離氨基酸吸收慢、載體易飽和、吸收時耗能高。Gilbert等[8]的研究發(fā)現(xiàn)PepT1基因在小腸的表達(dá)量與肉雞的飼料轉(zhuǎn)化率相關(guān)。王修啟等[9]發(fā)現(xiàn)PepT1 mRNA表達(dá)受到發(fā)育階段的調(diào)控。目前國內(nèi)對PepT1基因的多態(tài)性在家禽中的研究尚未見相關(guān)報道。

雞的PepT1主要在其腸道中表達(dá)，對蛋白營養(yǎng)吸收起著重要作，因此推斷它與飼料轉(zhuǎn)化效率有著一定的關(guān)系。本研究是以崇仁麻雞為材料，對PepT1基因的第4外顯子和第6外顯子進(jìn)行基因多態(tài)性研究，并對該基因與崇仁麻雞飼料轉(zhuǎn)化率的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析。進(jìn)一步深入研究該基因的變異性，有望發(fā)掘新的與飼料轉(zhuǎn)化率相關(guān)的分子標(biāo)記，進(jìn)而將有效標(biāo)記聚合到優(yōu)質(zhì)地方肉雞品系育種中，以提高地方雞飼料轉(zhuǎn)化率。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用樣本采自江西省崇仁縣國品麻雞有限公司，120日齡的崇仁麻雞原種300只，其中公100只和母200只。每個雞只翅靜脈采血，肝素鈉抗凝，置于冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室，－20℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 崇仁麻雞60 d上籠，上籠前稱取每只雞質(zhì)量，單籠單料槽飼養(yǎng)，自由飲水和采食，環(huán)境及營養(yǎng)水平一致，飼養(yǎng)全階段由專人管理。飼養(yǎng)至120日齡分別對每只雞進(jìn)行稱量，并稱取剩余料量。

1.2.2 基因組DNA提取與檢測 采用常規(guī)的飽和酚/氯仿抽提法，紫外分光光度法測定DNA純度后，取部分樣稀釋至100 ng/mL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank發(fā)布的雞PepT1基因序列(登錄號為:AY029615.1)，采用Primer5.0分別對它的第4外顯子和第6外顯子設(shè)計(jì)兩對引物，引物交由上海invitrogen公司合成。具體引物序列見表1。

表1 引物序列，產(chǎn)物大小及位置Tab.1 Primer sequence，corresponding PCR product size and position

1.2.4 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測 PCR 擴(kuò)增體系總體積為 25 μL，其中包括 10 × Buffer 2.5 μL、dNTPs 1 μL、引物 1 μL、TaqDNA 聚合酶 0.4 μL、DNA 模板 1 μL，雙蒸水 19.1 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50～60℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，經(jīng)33個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。引物不同，退火溫度也略有差異。

PCR產(chǎn)物檢測:將4 μL PCR產(chǎn)物與一定量的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合均勻，以1xTAE作為緩沖液，于20 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，電壓120 V，電泳時間30～40 min，紫外燈下檢測擴(kuò)增結(jié)果，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)照膠，拍照保存。

1.2.5 測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，用膠回收試劑盒(TIANGEN)回收目標(biāo)片段、純化后，交由上海

invitrogen服務(wù)有限公司DNA自動測序儀完成序列測定。

1.3 遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)不同基因型個體的數(shù)量，用POPGENE 32軟件分析基因的多態(tài)信息，包括等位基因頻率、基因型頻率以及多態(tài)信息含量，用擬合優(yōu)度檢驗(yàn)來檢驗(yàn)哈代－溫伯格平衡，其相應(yīng)的檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為皮爾遜卡方統(tǒng)計(jì)量。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對不同基因型與飼料轉(zhuǎn)化率進(jìn)行單因素方差分析?？紤]到樣本均是來自同場同批次等情況，建立了以下固定效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型。

Yij表示第j個試驗(yàn)雞的性狀值;u為總體均數(shù);Gi表示第i個Pept1基因型效應(yīng);eij為第j個觀察值的隨機(jī)誤差。結(jié)果用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示(Mean±SD)，當(dāng)所統(tǒng)計(jì)的樣本性狀方差齊次時，處理間均值的多重比較用最小極差法(LSD)法，當(dāng)所統(tǒng)計(jì)的樣本性狀方差不齊次時，處理間均值的多重比較用Tamhane檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取結(jié)果

從雞血樣中提取的基因組DNA溶于100 μL TE中，用8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明提取的基因組沒有降解，長度在50 kb以上。OD260/OD280比值均介于1.7～1.8，提取的DNA符合生物學(xué)試驗(yàn)要求。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用設(shè)計(jì)的引物對試驗(yàn)雞群的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段與目的片段大小一致，特異性良好，擴(kuò)增產(chǎn)物沒有非特異性條帶和引物二聚體，結(jié)果可以用來進(jìn)行直接測序(圖1和圖2)。

2.3 測序結(jié)果分析

本研究將PepT1基因引物PV1和PV2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后送invitrogen公司進(jìn)行測序，并用BioEdit 7.0軟件將測序結(jié)果分別與GenBank中PepT1基因的序列進(jìn)行了比對，確定SNP位點(diǎn)，并判斷基因型，以期研究不同引物在崇仁麻雞中的擴(kuò)增片段突變情況。

2.3.1 PepT1基因引物PV1的測序結(jié)果圖譜 將PV1測序結(jié)果和 GenBank的序列進(jìn)行比對，如圖3所示，PepT1基因PV1引物擴(kuò)增的是第4外顯子，在第4外顯子的第95位上檢測到有一處突變，由G→A。通過對所有雞只序列堿基和峰圖進(jìn)行觀察和分析，表現(xiàn)為3種基因型，即AA，AB和BB基因型。其中AA基因型的基因序列和GenBank中的一致，定義為野生型，AB基因型和BB基因型定義為突變型。

圖1 PV1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.1 The electrophoresis photograph of PV1 PCR products

圖2 PV2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳Fig.2 The electrophoresis photograph of PV2 PCR products

2.3.2 PepT1基因引物PV2的測序結(jié)果圖譜 將PV2測序結(jié)果和GenBank的序列進(jìn)行比對，如圖4所示，PepT1基因PV2引物擴(kuò)增的是第6外顯子，在第6外顯子檢測到有兩處突變，位于第6外顯子的第64位和第70位，分別是由C→G和A→G。且這兩個位點(diǎn)的變異具有同一性，當(dāng)C→G的時候，A→G，當(dāng)C不變時，A也不變。通過對所有雞只序列堿基和峰圖進(jìn)行觀察和分析，表現(xiàn)為兩種基因型，即AA和AB基因型。未見到BB基因型，推測BB基因型可能是致死或致病基因，在自然選擇中被淘汰。其中AA基因型的基因序列和GenBank中的一致，定義為野生型，AB基因型定義為突變型。

2.4 PepT1基因的遺傳學(xué)分析

2.4.1 基因的多態(tài)分析 對測序結(jié)果進(jìn)行基因型頻率、等位基因頻率和多態(tài)信息含量(PIC，polymorphism information content)的計(jì)算，并對其進(jìn)行 Hardy－Weinberg平衡檢驗(yàn)?；蛐皖l率指一個群體中某一性狀的各種基因型之間的相對比率，等位基因頻率是指一個群體中某個基因?qū)ζ涞任换虻南鄬Ρ嚷?。用多態(tài)信息含量值(PIC，polymorphism information content)來衡量基因變異程度高低、反映遺傳信息的多少[10]。多態(tài)信息含量是等位基因數(shù)和等位基因頻率的變化函數(shù)。當(dāng)位點(diǎn)PIC＞0.5時，該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn);當(dāng)位點(diǎn)0.25＜PIC＜0.5時為中度多態(tài);當(dāng)PIC＜0.25時為低度多態(tài)位點(diǎn)。由表2可知，在崇仁麻雞中PepT1基因PV1位點(diǎn)存在三種基因型(AA、AB、BB)，AB基因型最高，比率為0.504 7。而在PV2位點(diǎn)存在兩種基因型(AA、AB)，等位基因A占絕對優(yōu)勢，不存在BB基因型，其中AA基因型頻率顯著高于AB基因型。同樣由表2可得到，PV1位點(diǎn)在崇仁麻雞上表現(xiàn)為中度多態(tài)，PV2位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)。

2.4.2 基因的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 哈代－溫伯格定律也稱為遺傳平衡定律，實(shí)際觀測值與理論推斷值之間的偏離程度就決定了卡方值的大小?？ǚ街翟酱螅罹驮酱?，就越不符合Hardy-Weinberg平衡，相反，若卡方值越小，偏差就越小，就越是符合Hardy-Weinberg平衡，當(dāng)卡方值為0時，則說明理論值和實(shí)際觀測值完全相等?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，PV1和PV2位點(diǎn)在崇仁麻雞上均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)，說明崇仁麻雞群體性狀性比較穩(wěn)定，該品種仍具有較大的選育潛力。

圖3 PV1的SNP序列分析Fig.3 Sequence analysis on the isolated genotype of PV1

圖4 PV2的SNP序列分析Fig.4 Sequence analysis on the isolated genotype of PV2

表2 PepT1基因、基因型頻率、PIC及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab.2 Distribution of PepT1 genotype，allele frequency ，PIC and Hardy-Weinberg test

2.5 PepT1基因不同基因型與崇仁麻雞飼料轉(zhuǎn)化效率的相關(guān)性分析

對崇仁麻雞PepT1基因各SNPs基因型與飼料轉(zhuǎn)化效率進(jìn)行最小二乘分析，不同基因型各飼料轉(zhuǎn)化效率的均值和標(biāo)準(zhǔn)誤比較結(jié)果如表3所示，由表3可知，PepT1基因PV1位點(diǎn)的三種基因型和PV2位點(diǎn)的兩種基因型與崇仁麻雞飼料轉(zhuǎn)化效率均沒有顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

表3 不同基因型對崇仁麻雞飼料轉(zhuǎn)化率的影響Tab.3 Effect of different genotypes on Feed conversion rate of Chongren spotty Chicken

3 討論

蛋白質(zhì)吸收代謝機(jī)制一直是動物營養(yǎng)研究的重點(diǎn)，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)理論認(rèn)為蛋白質(zhì)只有被降解成游離氨基酸才能夠被機(jī)體吸收代謝。直到當(dāng)Ⅰ型小肽體(PepT1)在腸道被成功克隆后，小肽能被小腸吸收的觀點(diǎn)才逐漸被廣泛地接受。但國內(nèi)外報道對PepT1的研究幾乎都基于對其mRNA差異性比較以及對其機(jī)制的闡述和影響其活性調(diào)控的因素上，對于PepT1基因多態(tài)性的研究卻鮮見報道。此外，因測定飼料轉(zhuǎn)化效率難度大、成本高，對于飼料轉(zhuǎn)化率的研究也還較少，尤其對于飼料轉(zhuǎn)化率與小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因遺傳關(guān)系的相關(guān)研究十分罕見。國內(nèi)外研究者對飼料轉(zhuǎn)化率這一性狀，大多都是在營養(yǎng)水平上進(jìn)行研究，有關(guān)家禽中飼料轉(zhuǎn)化效率遺傳參數(shù)的研究較少，有研究認(rèn)為在純種與雜種蛋雞研究中，飼料利用率和采食量為中等遺傳力，體質(zhì)量遺傳力較高，飼料利用率與體質(zhì)量有高的正遺傳相關(guān)[11]。

本研究采用PCR產(chǎn)物測序的方法分析崇仁麻雞的PepT1基因，試圖檢測PepT1基因的單核苷酸多態(tài)性，并對其突變位點(diǎn)與崇仁麻雞飼料轉(zhuǎn)化率進(jìn)行相關(guān)性分析。分別對其第4外顯子和第6外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)了兩對引物PV1和PV2，其中引物PV1擴(kuò)增第4外顯子，引物PV2擴(kuò)增第6外顯子。測序分析結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了3個SNPs位點(diǎn)，均為沉默突變，不改變所編碼的氨基酸，其中第4外顯子上1個，即在第4外顯子的第95位上檢測到有一處突變，由G→A，發(fā)生了堿基之間的轉(zhuǎn)換;第6外顯子上2個，位于第6外顯子的第64位和第70位，分別是由C→G和A→G，發(fā)生了堿基之間的顛換和轉(zhuǎn)換。

目前，定位數(shù)量性狀位點(diǎn)的方法主要有基因組掃描和候選基因法，其中候選基因法應(yīng)用較多[12－13]。在候選基因法中，只要發(fā)現(xiàn)候選基因位點(diǎn)上存在多態(tài)性，便可直接研究此多態(tài)性與目標(biāo)性狀間的聯(lián)系。基因多態(tài)性的研究是確定某種特定基因?qū)仪萁?jīng)濟(jì)性狀是否有顯著影響的一種較為成熟的方法。Zhang等[14]研究了雞載脂蛋白B基因多態(tài)性和雞體質(zhì)量和腹脂的關(guān)聯(lián)分析;Cui等[15]報道了雞催乳素基因啟動子區(qū)的多態(tài)性對雞產(chǎn)蛋性狀的影響。張世卿、盧亞萍等[16－17]的研究發(fā)現(xiàn)溶菌酶對雞的生長發(fā)育有顯著影響。Nagaraja等[18]對白來航雞IGF－1基因5'端擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PstI消化后，所得基因型除了與蛋及蛋殼重有關(guān)外，與體質(zhì)量、攝食量和產(chǎn)蛋率等性狀沒有關(guān)系。Amills等[19]對雞IGF－1基因5'側(cè)翼區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)存在A/C突變，并報道突變與雞的生長和采食呈顯著相關(guān)。本研究分析了崇仁麻雞的PepT1基因的第4外顯子和第6外顯子序列，其中在第4外顯子上發(fā)現(xiàn)在了3種基因型，在第6外顯子上只發(fā)現(xiàn)2種基因型，缺少BB基因型，推測BB基因型可能是致病或致死基因型，從而在自然選擇中被淘汰。通過SPSS17.0軟件將基因型與飼料轉(zhuǎn)化率進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)這3個SNP位點(diǎn)所產(chǎn)生的各基因型與飼料轉(zhuǎn)化率之間均差異不顯著(P＞0.05)，造成差異不顯著的原因可能是樣本量太少，還有所選樣本只是根據(jù)表型選擇，還未進(jìn)行專門化品系選育，也有可能是PepT1基因的這3個多態(tài)位點(diǎn)與飼料轉(zhuǎn)化率就沒有關(guān)聯(lián)。因此筆者下一步的試驗(yàn)會針對飼料轉(zhuǎn)化效率對崇仁麻雞進(jìn)行選育，將PepT1基因作為與崇仁麻雞飼料轉(zhuǎn)化率相關(guān)的候選基因進(jìn)行深入的研究，探討PepT1基因在崇仁麻雞小腸各段的表達(dá)差異和不同飼料轉(zhuǎn)化率在同一腸段的表達(dá)豐度差異。通過基因和性狀的關(guān)聯(lián)分析，希望能找到能夠影響飼料轉(zhuǎn)化效率的主效基因或控制這些性狀的主效基因連鎖，為家禽的生產(chǎn)和選育提供理論依據(jù)。

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