鄧舜洲，冷 闖，張文波，許昌滿，胡 楊，鄒 柳，鄔向東，諶南輝 朱芝秀

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045)

Audhya等(1986)[1]采用層析技術(shù)從雞法氏囊中純化到一種三肽物質(zhì)(賴氨酰－組氨酰－甘氨酰胺，Lys-His-Gly-Amide，KHG-NH2，命名為Bursin，BS)，該三肽物質(zhì)能誘導(dǎo)家禽和哺乳動(dòng)物B細(xì)胞前體分化，而且發(fā)現(xiàn)人工合成的三肽囊素與從法氏囊提取的天然三肽囊素的生物學(xué)活性完全相同。之后，眾多的研究結(jié)果表明三肽囊素具有免疫增強(qiáng)作用:誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的分化[2]，提高機(jī)體抗體水平[3]，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腔上囊的發(fā)育等;三肽囊素對(duì)禽類和哺乳動(dòng)物均具有免疫增強(qiáng)作用[4]。基于三肽囊素對(duì)家禽、家畜的免疫增強(qiáng)作用，近年來，大量的三肽囊素的研究集中于作為一種免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)[5]。

建立三肽囊素免疫學(xué)檢測(cè)方法，以及進(jìn)行三肽囊素噬菌體模擬表位肽的篩選等研究，需依賴高親和力、特異性的抗三肽囊素抗體，但三肽囊素為小分子物質(zhì)(分子量為339.97，結(jié)構(gòu)式見圖1)，須與載體偶聯(lián)后才具有免疫原性。因此，制備三肽囊素人工抗原是研制抗三肽囊素多克隆或單克隆抗體的前提。三肽囊素分子上有多個(gè)氨基(圖1)可用于與載體蛋白偶聯(lián)，載體蛋白與不同位置氨基偶聯(lián)制備的人工抗原免疫小鼠均可能獲得三肽囊素多抗或單克隆抗體，但以該抗體為配體篩選的噬菌體模擬表位的免疫增強(qiáng)活性可能存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)方法(EDC法)使三肽囊素分子賴氨酰(K)上的N端氨基與載體蛋白的羧基的定向偶聯(lián)備三肽囊素人工抗原，免疫BABL/c鼠，成功制備了抗三肽囊素特異性多克隆抗體，并建立了三肽囊素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。

圖1 三肽囊素分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of Bursin

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三肽囊素(KHG-NH2，Bursin，BS)、1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumen，BSA)、雞卵清蛋白(Albumin from chicken egg white，OVA)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、羊抗鼠IgG HRP酶標(biāo)抗體均為Sigma產(chǎn)品。GKHG-NH2四肽、KHGK四肽均由上海波泰生物科技有限公司合成。6～8周齡BABL/c小鼠購自南昌大學(xué)動(dòng)物部。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三肽囊素人工抗原的制備[6]三肽囊素免疫抗原的制備:采用EDC法偶聯(lián)制備三肽囊素免疫原(合成路線見圖2)，牛血清白蛋白(BSA)、EDC和三肽囊素的反應(yīng)摩爾比為1∶30∶20。稱取20 mg牛血清白蛋白(BSA)溶于1mL PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH7.4)，加入1.69 mgEDC，振蕩反應(yīng)5 min;加入0.5 mL 三肽囊素溶液(溶于0.01 mol/L，pH7.4 PBS 緩沖液，含三肽囊素2 mg)，繼續(xù)振蕩反應(yīng)過夜;0.01 mol/L pH7.4 PBS 4 ℃透析 72 h，即為三肽囊素免疫抗原(BSA-KHG-NH2)。

三肽囊素檢測(cè)抗原(OVA-KHG-NH2)的制備:檢測(cè)抗原的制備方法與三肽囊素免疫原的制備方法相同，但反應(yīng)摩爾比不同，雞卵清蛋白(OVA)、EDC和三肽囊素的反應(yīng)摩爾比為1∶20∶15。

圖2 三肽囊素人工抗原BSA-KHG-NH222合成路線圖Fig.2 Steps for the synthesis of BSA-KHG-NH2

圖3 GKHG-NH2四肽分子結(jié)構(gòu)式Fig.3 Molecular structure of GKHG-NH2

圖4 KHGK四肽分子結(jié)構(gòu)式Fig.4 Molecular structure of KHGK

1.2.2 BABL/c小鼠的免疫 選擇6～8周齡的雌性BALB/c小鼠(5只)作為免疫動(dòng)物，三肽囊素人工抗原(BSA-KHG-NH2)與等量弗氏完全佐劑乳化，多點(diǎn)皮下注射(100 μg/0.2 mL/只)免疫。于第1次免疫2周后，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，取三肽囊素人工抗原(BSA-KHG-NH2)與等量弗氏不完全佐劑乳化后采用皮下注射加強(qiáng)免疫 (100 μg/只)，共免疫4次。

1.2.3 小鼠血清抗體效價(jià)測(cè)定 將三肽囊素檢測(cè)抗原(OVA-KHG-NH2)用0.01 mol/L PBS(pH7.4)分別稀釋為1.25、2.5、5、7.5、10、15 μg/mL，免疫小鼠血清(抗 BS 多克隆抗體)分別進(jìn)行 800 ～51 200倍比稀釋，通過方陣滴定確定BS檢測(cè)抗原(OVA-KHG-NH2)的包被濃度。

每次免疫后第14天斷尾采血，分離血清，以O(shè)VA-KHG-NH2為檢測(cè)抗原，采用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。

1.2.4 小鼠抗三肽囊素多克隆抗體的特異性測(cè)定 以O(shè)VA-KHG-NH2為檢測(cè)抗原，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(CI-ELISA)法檢測(cè)小鼠血清抗三肽囊素多克隆抗體的特異性。三肽囊素(BS)標(biāo)品、GKHG-NH2四肽、KHGK 四肽的競(jìng)爭(zhēng)抑制濃度分為 1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.906、1.953、0 ng/mL。分別以O(shè)D492值為縱坐標(biāo)，以三肽囊素(BS，結(jié)構(gòu)式見圖1)、GKHG-NH2四肽(結(jié)構(gòu)式見圖3)、KHGK四肽(結(jié)構(gòu)式見圖4)的濃度為橫坐標(biāo)繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。

1.2.5 三肽囊素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立 以方陣滴定的三肽囊素檢測(cè)抗原最佳包被濃度、小鼠抗血清最佳稀釋度為條件，建立三肽囊素的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。分別計(jì)算不同競(jìng)爭(zhēng)抑制濃度的結(jié)合率(Binding，%)，結(jié)合率(%)=加BS孔的OD492nm值/未加BS孔的 OD492nm值 ×100。以結(jié)合率為縱坐標(biāo)，以三肽囊素(BS)濃度為橫坐標(biāo)繪三肽囊素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5 BABL/c小鼠經(jīng)BSA-KHG-NH2免疫后的血清抗體效價(jià)Fig.5 Titer of antibody in sera of BABL/c mice immunized by BSA-KHG-NH2

2 結(jié)果分析

2.1 三肽囊素免疫抗原(BSA－KHG-NH2)的制備及免疫BALB/c小鼠

由于三肽囊素?zé)o紫外的特征吸收峰，且與載體蛋白(BSA、OVA)的全波長(zhǎng)紫外吸收譜一致，因此，無法通過紫外掃描方法確定BS分子與載體蛋白分子的偶聯(lián)比。本實(shí)驗(yàn)通過免疫小鼠后檢測(cè)是否產(chǎn)生特異性三肽囊素抗體確定三肽囊素人工抗原制備效果。本試驗(yàn)將BSA-KHG-NH2免疫5只 BALB/c小鼠，以 OVA-KHGNH2為檢測(cè)抗原，分別以間接ELISA法檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)。小鼠血清1 600倍稀釋，間接ELISA法檢測(cè)每次免疫后14 d的抗體水平，結(jié)果顯示第三次免疫后抗體水平明顯上升(圖5)，經(jīng)四次免疫后5號(hào)小鼠抗體效價(jià)達(dá)1∶125 000，表明本實(shí)驗(yàn)制備的三肽囊素人工抗原具有良好的免疫原性，3只免疫小鼠產(chǎn)生了高水平的抗體。

圖6 三肽囊素、GKHG－NH2四肽、KHGK四肽的阻斷試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The results of inhibitive tests by BS，GKHG-NH2and KHGK peptides

圖7 三肽囊素多克隆抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELESA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The indirect competitive ELISA curve of mouse anti-BS polyclonal

2.2 抗體的特異性測(cè)定及人工抗原偶聯(lián)基團(tuán)的驗(yàn)證

小鼠抗三肽囊素多克隆抗體方陣滴定確定的最佳條件為:BS檢測(cè)抗原(OVA-KHG-NH2)最佳包被濃度為10 μg/mL(溶于0.01 mol/L pH7.4 PBS)，多克隆抗體(5號(hào)小鼠免疫血清)工作濃度為1∶6 400。三肽囊素、GKHG-NH2四肽、KHGK四肽的阻斷試驗(yàn)結(jié)果(圖6)顯示小鼠血清多克隆抗體與三肽囊素檢測(cè)抗原的結(jié)合能被三肽囊素標(biāo)品特異性阻斷，表明免疫小鼠產(chǎn)生了抗三肽囊素的特異性抗體;能被GKHG-NH2四肽特異性阻斷，且GKHG-NH2的阻斷效果優(yōu)于三肽囊素，但不能被KHGK四肽阻斷，證明本實(shí)驗(yàn)制備的三肽囊素人工抗原是由三肽囊素分子賴氨酰(K)上的N端氨基與載體蛋白的羧基偶聯(lián)而成，達(dá)到了載體蛋白與三肽囊素特定基團(tuán)定向偶聯(lián)的目的。

2.3 三肽囊素間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的建立

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測(cè)下限為15 ng/mL，線性范圍在15～1 000 ng/mL之間，50%競(jìng)爭(zhēng)抑制的三肽囊素(BS)濃度(IC50)為160 ng/mL，回歸方程為Y=128.33－15.449ln(x)(圖7)。

3 討論

三肽囊素分子量為339.97，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只有反應(yīng)原性而無免疫原性，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后不能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但將它連接到大分子載體上后就能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。為研制抗三肽囊素抗體，本實(shí)驗(yàn)首先制備三肽囊素人工抗原。在制備小分子物質(zhì)人工抗原中，選擇哪個(gè)基團(tuán)與載體蛋白偶聯(lián)至關(guān)重要，應(yīng)盡可能避開空間結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的位置(如分子中的羰基、環(huán)結(jié)構(gòu)等)與載體蛋白偶聯(lián)，否則難以獲得高水平的特異性抗體，其原因在于抗體與小分子半抗原的特異性結(jié)合與分子的空間構(gòu)象密切相關(guān)[7]。三肽囊素分子(KHG-NH2，圖1)與載體蛋白偶聯(lián)的基團(tuán)有三個(gè)氨基(分別位于K、G)，其中K上的N端氨基不僅反應(yīng)活性遠(yuǎn)高于其他二個(gè)氨基，且K上的N端氨基離三肽囊素分子上羰基等基團(tuán)較遠(yuǎn)，因此，本研究選擇K上的N端氨基與載體蛋白的羧基偶聯(lián)制備三肽囊素人工抗原。小鼠抗三肽囊素多克隆抗體與檢測(cè)抗原的結(jié)合能被三肽囊素、GKHG-NH2四肽特異性阻斷，但不能被KHGK四肽阻斷，表明本實(shí)驗(yàn)制備人工抗原時(shí)載體蛋白的羧基與三肽囊素分子賴氨酰(K)上的N端氨基定向偶聯(lián)。與文獻(xiàn)報(bào)道[8]不同之處在于:本實(shí)驗(yàn)以EDC為偶聯(lián)劑制備人工抗原過程中，首先將EDC與載體蛋白反應(yīng)，之后加入三肽囊素，在控制反應(yīng)摩爾比的條件下可以保證載體蛋白的羧基與半抗原分子上最活潑的氨基定向偶聯(lián)。

三肽囊素免疫抗原(BSA-KHG-NH2)免疫小鼠后，小鼠免疫應(yīng)答產(chǎn)生的大部分抗體為抗載體蛋白BSA的抗體。為檢測(cè)免疫小鼠是否產(chǎn)生了抗三肽囊素特異性抗體，避免抗載體蛋白抗體的干擾，檢測(cè)抗原的載體蛋白選擇了卵清蛋白(OVA)。經(jīng)過四次免疫后，1、3、5號(hào)小鼠均產(chǎn)生了較高的抗體水平(其中5號(hào)小鼠抗體水平達(dá)1∶125 000)，且能被三肽囊素標(biāo)品特異性阻斷，此結(jié)果表明:本研究成功地制備了三肽囊素人工抗原，免疫BABL/c小鼠后產(chǎn)生了高水平的三肽囊素特異性抗體，也為今后抗三肽囊素單克隆抗體的制備、篩選三肽囊素模擬表位研究奠定了基礎(chǔ)。

諶南輝等(1997)通過戊二醛法將三肽囊素與載體蛋白偶聯(lián)制備人工抗原，并制備了單克隆抗體[9]。劉國(guó)輝(2008)[10]采且SMCC法使三肽囊素氨基與載體蛋白羧基偶聯(lián)制備人工抗原，獲得一株單克隆抗體，以該單抗建立的三肽囊素ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為12.5～400 ng/mL。但這二篇文獻(xiàn)文中均未見免疫BABL/c小鼠多克隆抗體的三肽囊素阻斷試驗(yàn)，也未確定載體蛋白與三肽囊素分子的哪個(gè)基團(tuán)偶聯(lián)制備人工抗原。以本研究制備的多克隆抗體建立的三肽囊素ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)范圍為15～1 000 ng/mL，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到了劉國(guó)輝(2008)以單抗建立的ELISA檢測(cè)方法，但本研究以多克隆抗體建立的間接ELISA檢測(cè)方法的線性范圍更寬，根本原因在于人工抗原的制備方面(如偶聯(lián)基團(tuán)的選擇、偶聯(lián)方法、偶聯(lián)比)。本試驗(yàn)中也曾采用戊二醛法、SMCC法制備三肽囊素人工抗原，免疫小鼠后雖然能產(chǎn)生較高的抗體水平，但多抗與三肽囊素檢測(cè)抗原的結(jié)合均不能被三肽囊素標(biāo)品阻斷(表明未產(chǎn)生高滴度的三肽囊素特異性多克隆抗體)，可能是由于戊二醛法、SMCC法制備人工抗原均在三肽囊素與載體蛋白間引入了較復(fù)雜的偶聯(lián)臂，影響了三肽囊素特異性抗體的產(chǎn)生，而EDC法則直接將三肽囊素的氨基與載體蛋白的羧基偶聯(lián)，未引入偶聯(lián)臂。

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