戴希剛，包滿珠

(1.江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var.acephala)，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，兩年生草本植物，觀葉為主。由于耐寒性強(qiáng)，觀賞期長(zhǎng)，其已成為我國(guó)乃至全世界冬春季應(yīng)用最為廣泛的觀賞植物[1]。利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)，能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料和創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，提高育種效率。小孢子培養(yǎng)所得植株加倍后獲得的雙單倍體構(gòu)成的群體被稱為DH群體，由DH群體組成的育種品系就叫DH系，它在遺傳上是完全純合的，可以直接作為優(yōu)良親本應(yīng)用于品種改良[2]。小孢子培養(yǎng)獲得的DH群體由于發(fā)生基因分離重組，染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，故群體內(nèi)存在較大的遺傳多樣性。目前利用已較成熟的小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以快速?gòu)腇1中獲得DH群體[3－5]，但有關(guān)DH群體遺傳多樣性或遺傳差異的研究卻很少見報(bào)道。

分子標(biāo)記是分析種質(zhì)遺傳多樣性的有效工具。ISSR標(biāo)記因其操作簡(jiǎn)單、成本低，信息量大、多態(tài)性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[6]，現(xiàn)已被廣泛用于植物遺傳多樣性研究。齊迎春等[7]利用ISSR標(biāo)記對(duì)12份孔雀草自交系和4份孔雀草F1代及兩份萬壽菊材料進(jìn)行了遺傳分析，ISSR分類結(jié)果將18份材料按照自交系和雜合系及孔雀草的來源分為三大類。Zhang等[8]利用ISSR技術(shù)分析了來自中國(guó)9個(gè)種群的245個(gè)諸葛菜個(gè)體的遺傳變異性，種群間存在80.8%的遺傳變異，種群間存在16.43%的遺傳變異。Talebi等[9]利用ISSR技術(shù)對(duì)不同國(guó)家的47個(gè)基因型的Brassica rapa的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)與歐洲的基因型間存在相當(dāng)大的遺傳變異。而利用ISSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行DH群體遺傳多樣性的研究報(bào)道很少。

本研究利用ISSR標(biāo)記技術(shù)，對(duì)兩個(gè)基因型羽衣甘藍(lán)(“名古屋－紅”、P3)的DH群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，并采用系統(tǒng)聚類法將兩個(gè)基因型產(chǎn)生的DH系進(jìn)行聚類分析，為選用遺傳差異較大的DH系進(jìn)行雜交配組，選育出綜合性狀優(yōu)良的雜交一代品種提供參考，為利用DH群體進(jìn)行羽衣甘藍(lán)雜交育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從基因型“名古屋－紅”經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的DH群體中抽取46個(gè)株系，基因型P3(Q2704×Q4606的F1代)經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的DH群體中抽取41個(gè)株系，作為本研究的試驗(yàn)材料。

1.2 DNA 的提取

分別從供試材料各單株上取幼嫩葉片，參照王灝等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因組DNA。

1.3 ISSR 擴(kuò)增

1.3.1 擴(kuò)增體系及程序 ISSR引物為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)，由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括 2 μL 的 10 ×Buffer、1.5 mmol/L 的 MgCl2、0.2 mmo1/L 的 dNTP、1 U Taq DNA 聚合酶、0.5 μmol/L引物、20 ng模板DNA。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min，先94℃變性30 s，58復(fù)性45 s，72℃1 min 30 s，接著梯度降溫進(jìn)行復(fù)性，5個(gè)循環(huán)后穩(wěn)定在53℃復(fù)性，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)在PTC－100TM(Bio-Rad，USA)PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。

1.3.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE電泳檢測(cè) ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物加4 μL上樣緩沖液，在DYCZ-30型電泳儀上進(jìn)行非變性凝膠電泳分離。凝膠成分包括80 g/L聚丙烯酰胺、0.4 g/L過硫酸銨、0.5 g/LTEMED，電泳緩沖液為TBE，120 V電泳2～3 h。DNA片斷的分子量大小根據(jù)100 bp DNA Marker電泳遷移距離確定。用銀染法顯帶，顯帶步驟為①首先用0.5%冰醋酸+10%無水乙醇固定2次，每次6 min;②2 g/L Ag-NO3銀染12 min;③ddH2O清洗2次，每次30 s;④0.02 g/L Na2SO3浸泡30 s以降低背景;⑤15 g/L NaOH+0.4%甲醛顯色，至條帶清析;⑥7.5 g/L Na2CO3終止15 min;⑦ddH2O沖洗數(shù)次，保險(xiǎn)膜包裹保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

ISSR電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，有帶記為1，無帶記為0。用NTSYS-Pc 2.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)原始矩陣用SimQual程序求Jaccard相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。利用PopGene32軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)(the number of polymorphic loci，N)、多態(tài)位點(diǎn)比率[the percentage of polymorphic loci(%)，P]，Shannon多樣性指數(shù) PIC(polymorphism information content，I)及有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne);利用NTSYS－Pc 2.10e軟件，將由“1”和“0”生成的原始矩陣用UPGMA 方法進(jìn)行聚類分析;最后均通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性分析

選取1份材料進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，從38個(gè)ISSR引物中選取9個(gè)能夠獲得清晰條帶，反應(yīng)穩(wěn)定的ISSR引物(表1)。ISSR引物對(duì)不同群體的擴(kuò)增效率不一樣，并且擴(kuò)增的總帶數(shù)和多態(tài)性帶數(shù)的差異也較大。對(duì)于“名古屋－紅”的DH群體，9條ISSR引物共擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的多態(tài)性條帶104條(圖1 A)，大小在100～2 000 bp，其中多態(tài)性位點(diǎn)為85個(gè)，每條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為4－17條，平均11.56條;多態(tài)性位點(diǎn)比率為81.73%，平均多樣性指數(shù)(I)為 0.258 9;每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.225 3。對(duì)于P3的DH群體，9條ISSR隨機(jī)引物共擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的多態(tài)性條帶87條(圖1 B)，大小在 150 ～1 600 bp，其中多態(tài)性位點(diǎn)為69個(gè)，每條引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為6～13條，平均11.56條;多態(tài)性位點(diǎn)比率為79.31%，平均多樣性指數(shù)(I)為0.409 4;每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.468 9。P3的DH群體的平均多樣性指數(shù)比“名古屋－紅”的大，說明P3的DH群體多樣性比“名古屋－紅”的廣，且有效等位基因也較之多。這說明由P3小孢子培養(yǎng)得到的DH群體比“名古屋－紅”所得到的DH群體的基因型更豐富。

表1 ISSR分析所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used for ISSR analysis

圖1 ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.1 The profile of ISSR amplification

2.2 DH群體ISSR聚類分析

對(duì)ISSR結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖 2?！懊盼?－紅”的DH群體46個(gè)株系間相似系數(shù)范圍為 0.61 ～0.97，其中DN35和DN42之間的相似性系數(shù)最大為 0.97，DN5 和DN6之間的相似系數(shù)最小，相似程度小的還有DN6和DN13，DN6 和 DN24，DN7 和DN13等，它們之間的相似性系數(shù)均小于0.65(圖2 A)，表明這些株系之間存在較廣的遺傳多樣性，即是說他們的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。對(duì)P3 DH群體的41份材料進(jìn)行聚類分析(圖2 B)，結(jié)果表明，各株系間的相似系數(shù)范圍為0.56～0.91。其中，DP28和DP40之間的相似系數(shù)最小為0.56，而DP21與DP34之間的相似系數(shù)最大為0.91?？偟目磥?，P3的DH群體的遺傳多樣性范圍要比“名古屋－紅”的廣，即是說P3的DH群體內(nèi)各株系的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。在相似性系數(shù)為0.78處可將46個(gè)“名古屋－紅”的DH系分成5組，而在相似性系數(shù)0.75處可將41個(gè)P3的DH系分成5組。

圖2 羽衣甘藍(lán)“名古屋－紅”(A)和P3(B)的DH群體ISSR聚類圖Fig.2 Dendrograms of cluster analysis for DH population of ornamental kale cv.‘Red Nagoya’and P3 based on ISSR

3 討論

通過小孢子培養(yǎng)技術(shù)能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得基因型純合的株系。利用分子標(biāo)記對(duì)獲得的DH群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，期望不僅可以了解DH群體內(nèi)部的遺傳多樣性情況，而且希望得到在育種上有價(jià)值的單株之間遺傳背景上的差異，為選育到符合育種目標(biāo)的親本提供參考。本研究利用ISSR標(biāo)記檢測(cè)了2個(gè)DH群體的遺傳的多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個(gè)群體內(nèi)均存在較大的遺傳多樣性，但P3的DH群體內(nèi)各株系間遺傳關(guān)系比“名古屋－紅”群體內(nèi)各株系間的遺傳關(guān)系要遠(yuǎn)，這可能與DH群體的大小有關(guān)，也可能與起始材料的遺傳組成有關(guān)，如果用于小孢子培養(yǎng)的F1代雜種的原始親本之間的遺傳差異大，則小孢子再生植株間的遺傳多樣性也大。P3由不同來源的父母本雜交而成，其父本Q4606為高株、波浪葉、外葉綠色、心葉黃色，而其母本Q2704為矮生、皺葉、外葉深綠色、心葉紅色，兩者遺傳差異較大，因而其小孢子再生植株間的遺傳多樣性就大。祝師元[11]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜育137 DH群體進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，該DH群體單株之間的遺傳變異相對(duì)較小，群體單株之間的相似系數(shù)介于0.94～1.0，分析主要原因是小孢子培養(yǎng)來源育137恢復(fù)系是一個(gè)己經(jīng)經(jīng)過多代自交選擇的群體，在遺傳背景差異上已經(jīng)較為一致，所以以該材料小孢子培養(yǎng)獲得的DH群體單株間的遺傳背景差異較小，遺傳分離不明顯。這說明遺傳背景差異越大的材料，其小孢子培養(yǎng)而來的DH群體內(nèi)各單株間的遺傳多樣性就越大。

焦德麗等[12]利用SSR標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜DH群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，通過小孢子培養(yǎng)獲得的DH系遺傳多樣性比較豐富，且不同組合的DH系基因型多樣性不同，兩個(gè)DH群體共62個(gè)DH系的遺傳相似性范圍為0.41～0.92。這表明經(jīng)小孢子培養(yǎng)所得的DH群體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)較大的分離，群體內(nèi)存在很大的遺傳差異。張繼紅等[13]在分析大白菜DH群體的遺傳變異性時(shí)也獲得了同樣的結(jié)論。小孢子培養(yǎng)后，經(jīng)過基因重組可獲得遺傳上具有多樣性的DH群體，為親本選育提供提供了一個(gè)較大的、良好的選擇空間，在生產(chǎn)上具較重要的意義。

在聚類圖中可以看到DH群體內(nèi)有些株系間的遺傳相似性非常高，如DN35與DN42、DN8與DN9、DN22與DN25、DP25與DP31、DP21與DP34，它們之間的相似系數(shù)均在0.9以上，有的甚至接近1.0，其遺傳背景基本一致。這也就是說由同一親本獲得的DH群體中可能存在較多遺傳背景相似甚至一致的株系。一般而言，DH群體越大，出現(xiàn)重復(fù)單株的可能性就越大[14]。因此，在小孢子培養(yǎng)供體親本選擇上，應(yīng)該增加親本的來源范圍，加大親本供體數(shù)量，而相應(yīng)減少同一親本獲得的DH群體數(shù)量;同時(shí)應(yīng)該將表型選擇與分子標(biāo)記選擇相結(jié)合，既減少了不必要的重復(fù)，又增加了選擇的目的性，提高了選擇效率，增加了所需要的優(yōu)良性狀株系中選的幾率。

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