徐曉燕，唐 迪

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 大豆研究所，江蘇 南京 210095;2.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)部，江蘇 句容 212400)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重地受到土壤鹽漬化的影響，據(jù)估計(jì)全球有20%的灌溉土地受鹽害威脅[1]。而且次生鹽堿化土壤面積有不斷加劇的趨勢(shì)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大的損失。由于蒸騰作用和毛細(xì)管作用，鹽堿地表層土壤中更容易積累鹽分，因此種子萌發(fā)和幼苗早期生長(zhǎng)更易受到鹽害[2]，種子在鹽堿地表層土壤中順利萌發(fā)是幼苗生長(zhǎng)的先決條件。萌發(fā)，從狹義上講，是指種子吸水后，胚軸伸長(zhǎng)胚根突破種皮[3]。

大豆(Glycine max L.)作為油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，在食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占重要地位。栽培大豆屬于鹽敏感植物，提高大豆的耐鹽性是大豆抗性育種的重要課題之一。但目前對(duì)不同抗性大豆品種的蛋白質(zhì)差異的分子遺傳基礎(chǔ)仍然知之甚少。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為遺傳分析(如種內(nèi)，種間遺傳差異)提供了準(zhǔn)確的手段，其核心技術(shù)包括雙向電泳技術(shù)(2-dimensional gel electrophoresis，2-DE)和質(zhì)譜技術(shù)(mass spectrometry，MS)[4]。李春梅等[5]運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究野生大豆與栽培大豆種子蛋白的差異鑒定出5個(gè)蛋白，主要是與大豆抗性、抗?fàn)I養(yǎng)以及種子萌發(fā)相關(guān)的蛋白質(zhì)。宋浩等[6]通過對(duì)不同煙草青枯病抗性品種的蛋白質(zhì)組學(xué)比較，鑒定出22個(gè)蛋白，并推測(cè)其中2個(gè)可能與煙草對(duì)青枯病的抗病性密切相關(guān)。

Lee68是世界公認(rèn)的大豆耐鹽品種，N2899是本實(shí)驗(yàn)鑒定出的鹽敏感品種。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法在整體水平上比較了Lee68和N2899大豆萌發(fā)期幼苗的蛋白表達(dá)的差異，鑒定出與抗性和品種相關(guān)的蛋白，為用遺傳工程的方法改良大豆的耐鹽性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 研究材料 大豆種子N2899、Lee68，由國家大豆改良中心種質(zhì)資源研究室提供。

1.1.2 主要試劑 硫脲、甘氨酸、尿素、碘乙酰胺、三氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉(SDS)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、二硫代蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺為AMRESO分裝;載體兩性電解質(zhì)(pH3－10)、IPG預(yù)制膠條等均為Bio-Rad公司產(chǎn)品;蛋白酶抑制劑為Sigma公司產(chǎn)品;α－氨基－4－羥基肉桂酸(CCA)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)為Roche公司產(chǎn)品。過硫酸銨、三氯乙酸(TCA)等為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同萌發(fā)時(shí)期大豆種子樣品的準(zhǔn)備 選取干燥度一致、飽滿、種皮色澤正常的種子，經(jīng)1 g/LHgCl2溶液浸沒消毒2 min后用純水漂洗6次之后，置于18 mL純水、墊有雙層9 cm定性濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿30粒，蓋上蓋，25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中避光發(fā)芽。隨機(jī)選取了胚根突破種皮2～3 mm的種子為幼苗。

1.2.2 大豆幼苗可溶性蛋白2-DE樣品制備 用三氯乙酸/丙酮沉淀法，方法參照鄭蕊等[7]。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照 Bradford[8]。

1.2.3 幼苗可溶性蛋白的雙向電泳(2-DE) 上樣量1 mg蛋白，每個(gè)樣品重復(fù)3次，方法參照李春梅等[5]的報(bào)道。

1.2.4 考馬斯亮藍(lán)染色 ddH2O洗后，12%TCA固定2 h后。ddH2O洗，體積分?jǐn)?shù)為20%甲醇，1.6%磷酸，8%硫酸銨和0.08%考馬斯亮藍(lán)-G250染色16～24 h，ddH2O漂洗脫色。

1.2.5 2-DE圖像分析 2-DE膠用Bio-Rad公司VersaDoc 3000凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，PDQuest軟件進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、匹配、分子量和等電點(diǎn)計(jì)算及蛋白質(zhì)點(diǎn)量值的標(biāo)準(zhǔn)化分析等圖像的分析處理。

1.2.6 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析及鑒定 用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜分析，方法參照李春梅等[5]。質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫搜索參照Hajduch等[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lee68和N2899幼苗的雙向電泳圖譜

通過雙向電泳技術(shù)得到Lee68和N2899大豆萌發(fā)期幼苗的蛋白質(zhì)2-DE圖譜(圖1)。在pH 4～7，分子量10～116 ku，樣品經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，PDQuest軟件分析2-DE圖譜，Lee68和N2899分別平均檢測(cè)到665和654個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。從圖1中可以看出，蛋白質(zhì)在橫向和縱向都得到了較好的分離。同時(shí)用軟件分析得到Lee68和N2899的2-DE圖譜之間的蛋白質(zhì)點(diǎn)相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient)為0.812，表明Lee68和N2899幼苗之間的主要蛋白質(zhì)組成比較一致。在2-DE膠上為了準(zhǔn)確地反映蛋白質(zhì)點(diǎn)量的變化，每個(gè)點(diǎn)的量均表示為相對(duì)的量，即一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的量占該膠內(nèi)所有蛋白質(zhì)點(diǎn)總量的比。PDQuest軟件分析各個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)相對(duì)量在Lee68和N2899中的差異表達(dá)，其中質(zhì)量較好、重復(fù)性高、表達(dá)量變化超過2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)有52個(gè)。選取6個(gè)蛋白點(diǎn)做MALDI-TOF-MS分析，各蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)豐度如圖2。其中5個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(Spot1、Spot2、Spot4、Spot5和Spot6)在Lee68中表達(dá)量較高，而Spot3在N2899中表達(dá)量較高。

圖1 Lee68和N2899萌發(fā)期幼苗的雙向電泳圖譜Fig.1 2-DE maps of the Lee68 and N2899 seedlings

2.2 差異表達(dá)蛋白的 MALDITOF-MS分析及數(shù)據(jù)庫檢索

將這6個(gè)蛋白質(zhì)用MALDITOF-MS分析，以基質(zhì)峰、酶自動(dòng)降解片段峰進(jìn)行校正，去除角蛋白峰和胰酶自切峰，精確標(biāo)定強(qiáng)度為基質(zhì)峰強(qiáng)度2倍以上的峰，6個(gè)點(diǎn)均獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)，PMF數(shù)據(jù)用 MS-Fit搜索大豆UniGene庫初步鑒定出4個(gè)大豆，鑒定結(jié)果如表1。

圖2 6個(gè)差異蛋白點(diǎn)的相對(duì)量變化Fig.2 Histograms showing the volume changes of 6 differentially expressed spots

表1 差異表達(dá)蛋白PMF數(shù)據(jù)庫檢索的鑒定結(jié)果Tab.1 Differentially expressed proteins identified by PMF query

3 結(jié)論

種子在高等植物的生命周期中占據(jù)核心地位，種子萌發(fā)是幼苗生長(zhǎng)的先決條件，是植物豐產(chǎn)的基礎(chǔ)。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從整體水平上比較了耐鹽品種Lee68和鹽敏感品種N2899大豆萌發(fā)期幼苗的蛋白表達(dá)的差異，所鑒定的蛋白主要與抗性相關(guān)。發(fā)現(xiàn)與抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)(Spot1、Spot5、Spot6)在耐鹽大豆Lee68中表達(dá)量較高。Spot3在鹽敏感品種N2899中大量表達(dá)，但未能鑒定出該蛋白。Spot4通過數(shù)據(jù)檢索其為26 ku蛋白質(zhì)，但具體是何蛋白尚不清楚，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

Spot1、Spot6分別被鑒定為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶10(GST 10)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶9(GST 9)。植物中GSTs由多基因家族編碼，大豆中已克隆到25條序列全長(zhǎng)，GST的活性受氧化損傷的誘導(dǎo)[10]。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)植物抵御逆境脅迫和解除細(xì)胞毒素起著重要作用。王臻昱等[11]從野大豆鹽堿脅迫基因表達(dá)譜中篩選并克隆得到GST 19基因，將其導(dǎo)入苜蓿，研究發(fā)現(xiàn)GST 19顯著提高了轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽堿性。Ji等[12]將從野生大豆鹽堿脅迫基因表達(dá)譜中篩選并克隆得到GST基因(GsGST:GQ265911)導(dǎo)入煙草，顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性和耐鹽性。大量研究表明，GST能夠增強(qiáng)植物對(duì)干旱、低溫、機(jī)械損傷、鹽堿脅迫等多種逆境的耐受能力。本研究中GST 9、GST 10在Lee68中的表達(dá)量均高于N2899，表明這可能與品種間抗性差異有關(guān)，Lee68存在著比較強(qiáng)的耐鹽機(jī)制，為GST能否作為大豆的抗逆性指標(biāo)提供依據(jù)。

Spots5被鑒定為種子成熟蛋白PM36。種子成熟蛋白PM36在胚胎發(fā)生后期合成和積累，在種子萌發(fā)早期被降解，其有助于種子萌發(fā)階段幼苗的生長(zhǎng)[13]。Skriver和Mundy[14]推測(cè)種子成熟蛋白PM36可能與部分LEA蛋白一樣，在逆境條件下有保護(hù)植物細(xì)胞的作用。本研究中Lee68平均萌發(fā)時(shí)間為1.5 d，而N2899的平均萌發(fā)時(shí)間為2.1 d，種子成熟蛋白PM36在Lee68中的表達(dá)量高于N2899，可能與Lee68種子萌發(fā)更快，抗性更強(qiáng)相關(guān)。

當(dāng)然本研究中鑒定出的差異蛋白有限，今后將借助不同的蛋白鑒定技術(shù)鑒定出更多的蛋白。并用不同鹽質(zhì)量濃度處理大豆萌發(fā)期幼苗，進(jìn)一步研究耐鹽大豆和鹽敏感大豆之間的差異，為大豆耐鹽性性狀的改良提供有價(jià)值的基因來源。

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