徐敬娟，趙鳳琴

遼寧醫(yī)學院，遼寧錦州 121001

隨著冠狀動脈內溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)等方法的廣泛應用，再灌注治療成為急性冠脈綜合征的重要治療方法，與此同時再灌注損傷成為一大研究熱點。腎素-血管緊張肽-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在缺血再灌注損傷中起重要作用。國內外已有許多實驗證實，血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)對心肌缺血再灌注具有保護作用。本研究通過制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察血管緊張肽Ⅱ1型受體阻斷劑厄貝沙坦對缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影響及對梗死面積、心肌形態(tài)結構的影響，以探討在心肌缺血再灌注過程中，血管緊張肽Ⅱ1型受體阻斷劑厄貝沙坦對心肌保護作用的可能機制。

材料和方法

1 實驗動物和分組 健康成年雄性SD大鼠38只，體質量250~300 g，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，自由飲水。隨機分成3組，假手術組6只(0.9%氯化鈉注射液2 ml/d)、缺血再灌注(I/R)組16只(0.9%氯化鈉注射液2 ml/d)、厄貝沙坦組16只(厄貝沙坦30 mg/(kg·d))，每天中午灌胃，預處理1周。假手術組開胸穿線不結扎冠脈，其余兩組通過結扎左室前降支45 min，松開結扎在灌注120 min建立缺血再灌注模型。

2 試劑和儀器 厄貝沙坦由修正藥業(yè)有限公司提供；丙二醛(MDA)試劑盒肌鈣蛋白(troponin I，TNI)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；ELISA IL-6試劑盒和TNF-α試劑盒由美國R﹠D公司提供。小型動物呼吸機，小型動物心電圖機，p6分光光度計，酶標儀，顯微鏡，高速臺式離心機(美國Sigma公司)37℃恒溫水浴箱。

3 大鼠在體心肌I/R模型的建立 大鼠用20%烏拉坦(5 ml/kg)行腹腔麻醉后，接心電監(jiān)護儀檢測心電變化，氣管切開插管進行呼吸機輔助呼吸(頻率60/min，潮氣量20 ml/kg)。于胸骨左旁3~4肋間行縱行切口，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜，與冠狀動脈左前降支0.2~0.3 cm處，用4.0Prolene線穿過動脈，除對照組僅穿線不結扎外，其余兩組用一細小帶凹槽乳膠管墊于血管與結扎線之間，結扎45 min后沿凹槽剪斷結扎線，復灌120 min。結扎成功標準[1]：結扎線遠端心肌顏色發(fā)紺，心電圖表現(xiàn)QRS增高增寬，ST段抬高。再灌注成功標準：缺血部位心肌顏色恢復，以標準Ⅱ導聯(lián)抬高的ST段下降50%以上。

4 心肌組織病理學觀察 將心肌置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋后常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察病理變化。

5 血清IL-6、TNF-α含量檢測 大鼠造模成功后，每組隨機取10只，用注射器在右心房取血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，分成兩份，-80℃冰箱保存，待所有樣本收集完后，根據(jù)IL-6、TNF-α ELISA試劑盒說明書，檢測血清IL-6、TNF-α含量。

6 MDA、TNI含量檢測 按以上方法取血清后，按照說明書加試劑，用p6分光光度計檢測吸光度，根據(jù)公式計算血清MDA含量。血清中MDA含量=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)/(標準管吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度(10nmol/ml)肌鈣蛋白由生化全自動分析儀測定。肌鈣蛋白由生化全自動分析儀測定。

7 心肌梗死面積測定[2-3]除假手術組外，每組剩余6只大鼠再灌注后，重新結扎冠狀動脈左前降支，經(jīng)尾靜脈將2% Evans blue 1ml注入，待大鼠口唇發(fā)藍后，迅速取下心臟，0.9%冰氯化鈉注射液清洗，剪去心房和右心室，濾紙吸干表面水分，置-20℃冷凍30 min，沿長軸切成2 mm的薄片5張，將切片浸入5% TTC的磷酸緩沖液中(pH 7.4)37℃孵育30 min，以區(qū)分缺血未梗死區(qū)(淺紅色)和梗死區(qū)(灰白色)，10%甲醛固定24 h，藍色為正常心肌，淺紅色為缺血未梗死心肌，灰白色為梗死心肌。用計算機圖像分析軟件Image-Pro Plus 3.0計算梗死面積占左心室面積的百分比。

8 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理。實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 HE染色光鏡觀察(×400) A： 假手術組； B： 缺血再灌注組； C： 厄貝沙坦組Fig.1 Inflammatory cell infiltration(HE×400) in sham group(A), I/R group(B) and irbesartan treatment group(C)

表1 各組大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α、TNI濃度及梗死面積的比較Tab.1 Serum MDA, IL-6, TNF-α, TNI concentrations and infarction area in different groups(

表1 各組大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α、TNI濃度及梗死面積的比較Tab.1 Serum MDA, IL-6, TNF-α, TNI concentrations and infarction area in different groups(

aP＜0.01, vs group A; bP＜0.01, vs group B

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結 果

1 大鼠心肌組織病理形態(tài)變化 假手術組：心肌結構正常，心肌纖維排列整齊，無水腫、無炎細胞浸潤(圖1A)；缺血再灌注組：大范圍心肌纖維變性、斷裂，細胞核碎裂、溶解甚至消失，細胞空泡變性，細胞間質高度水腫，明顯充血，中度炎性細胞浸潤(圖1B)；厄貝沙坦組：心肌纖維排列基本正常，可見少量細胞核碎裂與溶解，細胞間質輕度水腫，少量炎細胞浸潤(圖1C)。見圖1。

2 厄貝沙坦預處理對大鼠相關指標的影響 缺血再灌注組和厄貝沙坦預處理組血清MDA、IL-6、TNF-α明顯高于假手術組(P＜0.01)；厄貝沙坦預處理組明顯低于缺血再灌注組(P＜0.01)。缺血再灌注組和厄貝沙坦預處理組肌鈣蛋白明顯增高，厄貝沙坦組肌鈣蛋白低于缺血再灌注組(P＜0.01)。與缺血再灌注組比較厄貝沙坦預處理能夠明顯減少心肌梗死面積(P＜0.01)。見表1。

討 論

血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensinⅡreceptor blockers，ARBs)廣泛應用于高血壓、心室重構的治療，近年應用于心肌梗死后的治療越來越多，有報道稱能減少再灌注心律失常的發(fā)生，降低心肌梗死病死率，對心肌缺血再灌注具有保護作用。

缺血再灌注后心肌組織的炎性反應被證明是再灌注損傷的重要機制[4]。缺血再灌注組與假手術組比較，缺血再灌注120 min后，血清炎性因子IL-6、TNF-α明顯升高(P＜0.01)，說明炎癥因子IL-6、TNF-α參與了心肌缺血再灌注損傷，與文獻報道一致。再灌注后心肌細胞損傷嚴重，且炎性細胞大量積聚，可能激活了炎性細胞如中性粒細胞、單核細胞等合成并釋放大量的炎性因子[5](IL-6、TNF-α)，這些炎癥遞質的升高又刺激中性粒細胞及心肌細胞表面黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達，誘導中性粒細胞黏附穿過內皮遷移至心肌缺血部位，造成對缺血部位炎細胞的浸潤及損傷，中性粒細胞可阻塞毛細血管，使心肌微循環(huán)的損傷程度加重[6]，增大梗死面積。IL-6、TNF-α主要由單核巨噬細胞、T細胞、B細胞以及內皮細胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的細胞因子，其水平與缺血后及再灌注后的損傷程度相關[7]，研究證明炎性因子(IL-6、TNF-α)的增加是心肌對損傷的一種應激反應，可誘導心肌細胞凋亡，增加心肌梗死面積。Neri Serneri等[8]報道雷米普利可顯著減少再灌注心肌TNF-α表達水平，與本實驗結果相符。

厄貝沙坦預處理組與缺血再灌注組比較，血清炎性因子IL-6、TNF-α顯著降低(P＜0.01)。損傷較缺血再灌注組明顯減輕，可能是由于厄貝沙坦減少了炎癥因子的合成和釋放，降低了炎癥因子引起中性粒細胞遷移浸潤，一定程度上阻止了惡性循環(huán)引起心肌細胞結構的破壞。減輕炎癥反應可減少微栓子阻塞、心肌細胞水腫、血管內皮損傷及心肌梗死面積。厄貝沙坦預處理可以在一定范圍內提高機體的免疫功能，維持細胞膜的穩(wěn)定性，對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。有研究報道[9]血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)預處理后可使血清IL-6、TNF-α明顯減少，減輕心肌再灌注損傷。炎癥在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用[10-11]。還有實驗研究顯示替米沙坦能通過直接抑制脂肪細胞促炎因子的生成而發(fā)揮抗炎作用[12]。

氧化應激也是心肌缺血再灌注損傷的主要機制之一[13]，MDA是氧自由基引發(fā)脂質過氧化反應的產(chǎn)物，其含量反映氧自由基水平和脂質過氧化的強度和速度，是了解氧自由基致機體組織損傷的重要指標之一。本實驗表明，厄貝沙坦能抑制脂質過氧化過程，減輕氧自由基對心肌的損傷。許多針對不同心血管疾病狀態(tài)的臨床研究都表明阻斷RAS可以減少炎癥作用和氧化應激，這可能是降低心血管意外的重要因素[14]。

厄貝沙坦預處理后，肌鈣蛋白(TNI)降低，說明心肌細胞損傷較輕。TNI存在心肌中，心肌細胞壞死后釋放入血，是臨床上檢測心肌梗死的重要生化指標。表明厄貝沙坦預處理可減少壞死心肌細胞和(或)對心肌細胞膜的通透性有保護作用。厄貝沙坦對心肌的保護作用可能有以下原因：1)當心肌梗死時，RAS系統(tǒng)被激活，產(chǎn)生大量的血管緊張素Ⅱ通過AT1受體導致細胞內Ca2+超載、血管內皮細胞損傷和中性粒細胞的激活，從而加重缺血再灌注心肌的損傷，厄貝沙坦可阻斷此作用，還可降低AT1受體的表達。2)加用厄貝沙坦阻斷AT1受體，導致血漿中增高血管緊張素II升高與AT2結合進而激活緩激肽-NO途徑，增加心肌局部NO濃度[15]，擴張冠狀動脈、改善內皮細胞功能、抑制血小板和白細胞在內皮細胞黏附和聚集，減輕心肌損傷，減少梗死面積。3)此外，本實驗研究，炎癥反應在心肌再灌注損傷中起重要作用，厄貝沙坦可減少炎癥因子的合成或釋放，抑制炎癥反應，減少脂質過氧化，從而減輕心肌細胞的損傷。

總之，心肌缺血再灌注損傷的機制繁多且復雜，厄貝沙坦對心肌缺血再灌注有一定的保護作用，能減輕氧自由基的損傷，降低炎癥因子的合成和釋放，這可能是它減輕再灌注損傷的一個重要途徑，其確切機制需待進一步研究。

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