張 睿

遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099

藥用真菌是一類具有藥用價(jià)值的真菌，即在菌絲體、子實(shí)體、菌核或孢子中能產(chǎn)生諸如氨基酸、蛋白質(zhì)多糖、苷類、生物堿、黃酮類及萜類等多種物質(zhì)，對(duì)疾病有預(yù)防、抑制或治療作用[1]。我國(guó)地域遼闊，自然條件和生態(tài)環(huán)境十分復(fù)雜，造成了藥用真菌種類的多樣性，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的藥用真菌大約500種，其中大型藥用真菌約有300多種，但已開發(fā)的大型藥用真菌只有20至30種[2]。藥理研究也集中在降血脂、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝等方面[3]，在諸多活性中，抗腫瘤活性最引人關(guān)注，且抗腫瘤活性成分主要為多糖、萜類物質(zhì)、蛋白及生物堿等[4]。研究以斑褐孔菌、裂蹄木層孔菌、苦白蹄、木蹄層孔菌為研究對(duì)象，對(duì)其石油醚提取物的體外抗腫瘤活性進(jìn)行初步研究，以期為這四種大型真菌的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑褐孔菌 (Fuscoporia punctata)、裂蹄木層孔菌(Phellinus rimosus)、苦白蹄 (Fomitopsis officinalis)、木蹄層孔菌 (Pyropolyporus fomentarius)，采自吉林省敦化市。人肺腺癌細(xì)胞A－549由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心提供。RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清，美國(guó)Gibco公司;胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、Tris堿，美國(guó)Amresco公司;磺酰羅丹明、DMSO，美國(guó)Sigma公司;其余試劑均為分析純。

R－210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司;3131型CO2培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司;單人超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Ti－S倒置相差顯微鏡，日本Nikon公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石油醚提取物的制備 真菌子實(shí)體60℃烘干、粉碎、稱取粉末100g，加1L石油醚60℃連續(xù)回流提取兩次，每次3h。合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得浸膏，60℃烘干后得樣品斑褐孔菌石油醚提取物 (PEFP)、裂蹄木層孔菌石油醚提取物 (PEPR)、苦白蹄石油醚提取物 (PEFO)、木蹄層孔菌石油醚提取物 (PEPF)。精密稱取樣品10mg，用100μL DMSO溶解，臨用前用完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞A－549用RPMI－1640完全培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 SRB法測(cè)定提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 參照文獻(xiàn)[5]方法略有改動(dòng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A－549細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為10000個(gè)/mL，每種細(xì)胞平行接種兩塊96孔板，分別為對(duì)照板 (T0)和實(shí)驗(yàn)板 (T)。每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h后，對(duì)照板細(xì)胞用預(yù)冷的50%三氯乙酸 (TCA)固定，待測(cè);同時(shí)實(shí)驗(yàn)板中加入100μL的提取物 (調(diào)節(jié)終濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL)，陰性對(duì)照孔 (C)加入含有相同濃度 DMSO的培養(yǎng)基。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后取出培養(yǎng)板，50%的TCA 4℃固定1h，去離子水洗板，自然干燥，SRB染色，10min后用0.1%醋酸洗板，自然干燥，200μL Tris液溶解，530nm處測(cè)吸光度值 (OD值)，按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。并采用寇氏改良法計(jì)算各提取物對(duì)A－549的半數(shù)抑制濃度 (IC50)。

寇氏改良法計(jì)算公式:lgIC50=Xm－I(P－ (3－Pm－Pn)/4)(Xm:lg最大劑量;I:lg(最大劑量/相臨劑量);P:陽(yáng)性反應(yīng)率之和;Pm:最大陽(yáng)性反應(yīng)率;Pn:最小陽(yáng)性反應(yīng)率)

2 結(jié)果

2.1 對(duì)肺癌A－549細(xì)胞增殖的影響PEFP、PEFO、PEPR、PEPF作用于人肺腺癌細(xì)胞A－549細(xì)胞48h以后，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用見表1、2。PEFP、PEFO、PEPF對(duì)A－549均具有抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的增大而增大，呈劑量依賴關(guān)系。其中，PEFP對(duì)A－549的抑制作用最強(qiáng)，而PEPR對(duì)A－549的增殖沒有影響。寇氏改良法計(jì)算PEFP、PEFO 對(duì) A －549的 IC50，分別為 55.99μg/mL、67.55μg/mL。

表1 PEFP、PEPR對(duì)A－549細(xì)胞增殖的影響(±S，n=5)

表1 PEFP、PEPR對(duì)A－549細(xì)胞增殖的影響(±S，n=5)

注:“－”表示缺省;“*”表示與陰性對(duì)照組比較，P＜0.05。下同。

組別 藥物濃度(μg/mL)PEFP PEPR OD值 抑制率 (%) OD值 抑制率 (%)對(duì)照組 －0.24±0.01 － 0.24±0.01 －陰性對(duì)照組 － 1.48±0.03 － 1.53±0.05 －實(shí)驗(yàn)組 10 1.14±0.07* 27.42 1.26±0.02* 20.93 20 1.06±0.05* 33.87 1.23±0.06* 23.26 40 0.94±0.04* 43.55 1.19±0.01* 26.36 60 0.71±0.05* 62.10 1.09±0.06* 34.11 80 0.62±0.02* 69.35 0.81±0.06* 55.81 100 0.57±0.03* 73.39 0.67±0.04*66.67

表2 PEPR、PEPF對(duì)A－549細(xì)胞增殖的影響 (±S，n=5)

表2 PEPR、PEPF對(duì)A－549細(xì)胞增殖的影響 (±S，n=5)

組別 藥物濃度(μg/mL)PEFP PEPR OD值 抑制率 (%) OD值 抑制率 (%)對(duì)照組 －0.24±0.01 － 0.24±0.01 －陰性對(duì)照組 － 1.48±0.03 － 1.53±0.05 －實(shí)驗(yàn)組 10 1.14±0.07* 27.42 1.26±0.02* 20.93 20 1.06±0.05* 33.87 1.23±0.06* 23.26 40 0.94±0.04* 43.55 1.19±0.01* 26.36 60 0.71±0.05* 62.10 1.09±0.06* 34.11 80 0.62±0.02* 69.35 0.81±0.06* 55.81 100 0.57±0.03* 73.39 0.67±0.04*66.67

2.2 斑褐孔菌對(duì)肺癌A－549細(xì)胞形態(tài)的影響 由圖1所知，陰性對(duì)照組的細(xì)胞正常生長(zhǎng)，細(xì)胞膜完整，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞貼壁緊密;細(xì)胞經(jīng)IC50濃度的PEFP作用48h后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體積變小，大部分細(xì)胞凋亡或壞死，細(xì)胞膜破裂，懸浮在培養(yǎng)基中，已經(jīng)不能見到完整的細(xì)胞。

圖1 斑褐孔菌石油醚提取物對(duì)A－549細(xì)胞形態(tài)的影響 (×100)

3 結(jié)論與討論

通過斑褐層孔菌、裂蹄木層孔菌、苦白蹄、木蹄層孔菌四種大型多孔類真菌石油醚提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞A－549細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，斑褐層孔菌、苦白蹄石油醚提取物對(duì)A－549具有較好的抑制效果;木蹄層孔菌的抑制效果不明顯;裂蹄層孔菌對(duì)A－549沒有抑制作用。在后期的研究工作中將會(huì)針對(duì)活性較好的斑褐層孔菌、苦白蹄的石油醚提取物進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，希望能發(fā)現(xiàn)更有價(jià)值的活性組分或單體化合物。

實(shí)驗(yàn)采用SRB檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，該法是美國(guó)國(guó)立癌癥研究所 (National Cancer Institute，NCI)篩選抗癌藥物的一種新方法，能克服MTT法成色反應(yīng)的時(shí)間依賴性，測(cè)定結(jié)果幾乎不隨時(shí)間而變，不失為一種篩選抗癌藥物的好方法。結(jié)合藥理篩選廣泛開展抗腫瘤真菌的基礎(chǔ)研究，尋找抗腫瘤活性先導(dǎo)化合物一方面可促進(jìn)我國(guó)豐富真菌資源的開發(fā)和利用，另一方面可為抗腫瘤新藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

[1]徐錦堂.中國(guó)藥用真菌學(xué)[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997.3.

[2]殷培峰，浦冠勤.中國(guó)藥用真菌研究進(jìn)展[J].滁州學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10(6):58－60.

[3]王謙，賈震.食藥用真菌的藥理作用研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥研究與教育，2010，27(5):67－69.

[4]閆黎，許立，李霞.真菌中抗腫瘤活性成分的作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18(8):740－742.

[5]Vanicha Vinchai，Kanyawin Kirtikara.Sulforhodamine Bcolorimetric assay for cytotoxicity screening[J].Nature Protocols，2006，1(3):1112－1116.