李文君 周正新

1.安徽省六安市中醫(yī)院，安徽 六安 237006;2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031

激素性股骨頭缺血性壞死 (Steriod－induced avascular necrosis of femoral head簡(jiǎn)稱SANFH)是指因?yàn)榇髣┝繎?yīng)用激素而造成股骨頭骨的活成份 (骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞和脂肪細(xì)胞)死亡所引起的病理過(guò)程。中醫(yī)藥療法在早期防治激素性股骨頭缺血性壞死方面具有一定的優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討中藥骨蝕寧Ⅰ號(hào)膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)SANFH兔TGF－β1表達(dá)的影響，為骨蝕寧Ⅰ號(hào)膠囊在臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康8月齡的SPF級(jí)長(zhǎng)耳新西蘭大白兔40只，體重 (2.0±0.5)㎏，雌雄兼?zhèn)?，雌?1只，雄性19只，均由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組 (n=4)、骨蝕寧膠囊組 (n=12)、模型組 (n=12)和仙靈骨葆對(duì)照組 (n=12)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置均符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[1]。實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心及安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科。

1.2 建立SANFH動(dòng)物模型 采用安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供健康8月齡長(zhǎng)耳新西蘭大白兔40只，體重 (2.0±0.5)kg/只，雌雄兼用，SPF級(jí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食、飲水，室溫控制在22～25℃。隨機(jī)選取4只為正常組，余36只用于造模;每間隔24h于兔耳緣靜脈注射大腸桿菌內(nèi)毒素，每次50μg/kg，共注射2次，并于第二次注射內(nèi)毒素24h后肌肉內(nèi)注射甲基強(qiáng)的松龍20mg/(kg·d)，連續(xù)注射3d，每次間隔24h。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每周臀部注射青霉素20萬(wàn)U，預(yù)防感染。制備成典型的骨壞死動(dòng)物模型。

1.3 給藥方法 造模后將各組置于同等條件下喂養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥換算公式 (Db=Da*Rb/Ra*(Wa/Wb)1/3(其中Db為兔子公斤體重劑量，Da為成人公斤體重劑量，Rb、Ra為體型系數(shù)，分別等于0.093、0.1，Wb、Wa為已知?jiǎng)游矬w重，兔子體重按照平均體重2kg計(jì)算，成人體重按照標(biāo)準(zhǔn)體重60kg計(jì)算，即Db=0.47g)計(jì)算給藥量，按以上公式分別計(jì)算出，骨蝕寧組1.41g/kg·d(按體表面積計(jì)算，相當(dāng)于成人服骨蝕寧Ⅰ號(hào)方每天用量10g的3倍);對(duì)照組藥用仙靈骨葆按1.92g/kg·d(相當(dāng)于成人每天總量的13.5g/d的3倍)灌服。各用藥組將藥物用蒸餾水配成藥液15ml灌胃，模型組用生理鹽水15ml灌胃，每日灌胃一次。

1.4 標(biāo)本采集 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于第8周取出股骨頭，取股骨頭前禁食、水12小時(shí)。耳緣靜脈注射空氣處死動(dòng)物，取出右側(cè)股骨頭，將全部股骨頭負(fù)重區(qū)沿冠狀面剖開(kāi)，軟骨下區(qū)切取1.0 mm×1.5 mm×1.0mm組織，進(jìn)行觀察和檢測(cè)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法 標(biāo)本常規(guī)HE染色，TGF－β1采用免疫組化分析法進(jìn)行檢測(cè)，石蠟切片 (Leica RM2135，厚度4微米)置入10%中性甲醛中固定，取EDTA200g，加入1000ml雙蒸水，攪拌，制成脫鈣液，保持恒溫25～28℃，浸泡約3～4周，每隔3天更換脫鈣液，以針順利刺入骨頭無(wú)阻力為脫鈣終點(diǎn)，然后逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，TGF－β1免疫組化染色封片后，在熒光顯微鏡10×40倍的鏡下進(jìn)行觀察，在最大清晰度、最小灰度、最低的失真度下對(duì)陽(yáng)性表達(dá)最明顯之處進(jìn)行數(shù)碼攝片，每張標(biāo)本片分別攝片三次，把攝得的照片輸入電腦，用捷達(dá)DP－801分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行TGF－β1的平均光密度進(jìn)行分析得到數(shù)據(jù)，把同一張標(biāo)本片的三張照片所分析得到的數(shù)值進(jìn)行求平均值即為該標(biāo)本的一個(gè)原始數(shù)據(jù)，把得到的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

第8周模型組家兔與同期對(duì)照組、骨蝕寧組TGF－β1表達(dá)比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)。(見(jiàn)下表1)

表1 不同組間TGF－β1免疫組化平均光密度統(tǒng)計(jì)分析 (±s，n=12)

表1 不同組間TGF－β1免疫組化平均光密度統(tǒng)計(jì)分析 (±s，n=12)

注:與對(duì)照比較，*P＜0.05;與骨蝕寧組比較#P＜0.05。

組別 第8周0.4719±0.01007對(duì)照組 0.5034±0.01600骨蝕寧組 0.5640±0.00743模型組 0.2344±0.14 168*#正常組

3 討論

骨蝕寧膠囊是安徽中醫(yī)院大學(xué)丁鍔教授在長(zhǎng)期治療SANFH的臨床實(shí)踐中，遵循《黃帝內(nèi)經(jīng)》:“結(jié)者散之，留者攻之”的理念，推廣“活血、祛瘀、生新”的治療原則，提出了以活血化瘀、補(bǔ)腎壯骨的基本治則[2]。丁教授認(rèn)為股骨頭的生理、解剖特點(diǎn)和股骨頭壞死的病機(jī)特點(diǎn)，決定了其所形成的“瘀血”并不同于一般的病癥，常規(guī)活血化瘀藥物難以直達(dá)病所，只有配合蟲類藥物才能剔刮深達(dá)筋骨之瘀血與痰濁。在此基礎(chǔ)上，再結(jié)合臨床治療脫疽有效藥物的實(shí)踐，研制骨蝕寧Ⅰ號(hào)方，由穿山甲20g、當(dāng)歸30g、川芎20g、蜈蚣20g、全蝎20g、土鱉蟲25g、地龍30g、水蛭30g、肉桂10g、姜黃30g、冰片6g組成，共收破瘀通絡(luò)之功。

TGF－β是一組具有多功能性蛋白多肽，對(duì)多種結(jié)締組織具有復(fù)雜生物效應(yīng)的生長(zhǎng)因子，其主要來(lái)源于淋巴細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等。尤以在血小板和骨組織含量最為豐富，TGF－β的生物學(xué)作用非常廣泛，可以促進(jìn)各類軟組織損傷修復(fù)、促進(jìn)血管生長(zhǎng)[3－4];參與體內(nèi)許多炎癥反應(yīng)及組織修復(fù);并參與骨與軟骨的形成。有研究表明TGF－β1在軟骨形成過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[5]。TGF－β在骨修復(fù)中所表現(xiàn)的作用體現(xiàn)為對(duì)破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)。TGF－β對(duì)細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的作用表現(xiàn)為雙向效應(yīng)，其既能刺激細(xì)胞增殖分化，也能對(duì)其抑制。如果周圍環(huán)境比如細(xì)胞群分化狀態(tài)及生長(zhǎng)條件不同，則TGF－β對(duì)細(xì)胞群的作用就顯著不同，但一般來(lái)說(shuō)，低濃度TGF－β起刺激作用，高濃度時(shí)起抑制作用。對(duì)成骨細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)則表現(xiàn)為促進(jìn)合成Ⅰ型膠原、骨橋蛋白和骨粘連素。此外，TGF－β還可能通過(guò)下列2種途徑從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成:①刺激成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞中蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生(譬如纖維蛋白溶酶原活化劑的抑制劑);②抑制成骨細(xì)胞中蛋白酶的產(chǎn)生以及抑制成纖維細(xì)胞中琉基酶和金屬蛋白的產(chǎn)生?；趯?duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成的有明顯促進(jìn)作用，認(rèn)為TGF－β在創(chuàng)傷愈合、新骨形成、骨組織的修復(fù)及重建過(guò)程中起重要作用。

短期內(nèi)大劑量應(yīng)用激素造成股骨頭區(qū)血液供應(yīng)中斷，局部出現(xiàn)缺血，致使骨的活性成份壞死。有研究表明，在股骨頭壞死的不同階段，組織勻漿TGF－β的表達(dá)情況不同，且隨著病情的增加，TGF－β的表達(dá)量逐漸減少[6]。骨缺血壞死后隨著機(jī)體對(duì)壞死區(qū)修復(fù)的激活，修復(fù)細(xì)胞產(chǎn)生TGF－β1的量逐漸增多。本研究顯示給予激素性股骨頭缺血壞死實(shí)驗(yàn)兔骨蝕寧治療后，股骨頭局部TGF－β1的表達(dá)上調(diào);模型組TGF－β1的表達(dá)顯著降低，表達(dá)趨勢(shì)恰好相反。表明骨蝕寧膠囊可以促進(jìn)激素性股骨頭缺血壞死模型兔股骨頭局部TGF－β1的表達(dá)。組間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，骨蝕寧組作用顯著。表明骨蝕寧膠囊可促進(jìn)激素性股骨頭缺血壞死模兔股骨頭局部TGF－β1的表達(dá)，從而促進(jìn)壞死股骨頭的修復(fù)。

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