張 玨 鄧媛媛 曾富佳

遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563000

四環(huán)素及其無抗生素作用的化學(xué)異構(gòu)衍生物 (CMTs)具有特殊的藥理活性:抑制基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)、抑制骨吸收、恢復(fù)成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能等[1，2]，這些性質(zhì)在骨科具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。前期研究證實(shí)低濃度鹽酸四環(huán)素，可促進(jìn)體外培養(yǎng)的人胚成骨細(xì)胞活性及增殖，增加和加強(qiáng)細(xì)胞合成I型膠原、骨鈣素等促進(jìn)骨生成的物質(zhì)[3]，提示鹽酸四環(huán)素有較強(qiáng)促成骨潛能。而利用緩釋系統(tǒng)控制鹽酸四環(huán)素在組織中持續(xù)穩(wěn)定的緩慢釋放，更能滿足骨愈合再生生理學(xué)規(guī)律的要求。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)制備的鹽酸四環(huán)素緩釋微球[4]用于成骨細(xì)胞增殖作用的研究，確定鹽酸四環(huán)素緩釋微球潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器 3～7d齡健康SD大鼠10只，雌雄不限，體重20～30g(四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);鹽酸四環(huán)素緩釋微球;胎牛血清 (FBS，美國Gibco);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco);Ⅰ型膠原酶 (美國Sigma);胰蛋白酶 (美國Gibco);二甲亞砜 (DMSO，美國Sigma);MTT(美國Sigma);倒置相差顯微鏡 (日本Olympus);離心機(jī) (德國eppendorf公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (德國Thermo公司);細(xì)胞超凈工作臺(tái) (德國Thermo);連續(xù)光譜測讀儀 (美國Bio－Rad)。

1.2 方法和結(jié)果

1.2.1 SD大鼠成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定 在無菌條件下剪取10只3～7d齡SD大鼠顱頂骨，用無菌PBS沖洗，并除去骨膜骨縫間結(jié)締組織和血細(xì)胞，將顱頂骨剪成約1mmx1mm碎塊，加入0.25%胰蛋白酶10ml，37℃條件下消化振蕩10 min，棄上清，加入1∶1(V/V)0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶的混合酶10ml，37℃消化振蕩20 min，并重復(fù)消化1次，收集2次消化的消化液，以400G·min－1離心5min。棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后按1x104·cm－2個(gè)細(xì)胞密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3d后首次換液，以后間隔2天換液。待細(xì)胞長滿至80%～90%融合后，消化并按1∶2比例傳代，倒置相差顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞的生長情況和形態(tài) (圖1)，可見成骨細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形、三角形或多角形。取第2代細(xì)胞按1×104·cm－2密度分別接種于有血蓋片的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)21d，取出血蓋片，PBS清洗，行茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色鑒定 (圖2)，其結(jié)果顯示成骨細(xì)胞培養(yǎng)21d后有明顯的紅色鈣結(jié)節(jié)生成。收集第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為二組，A組:空白對(duì)照組 (含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液);B組:鹽酸四環(huán)素緩釋微球組(含10%FBS和四環(huán)素緩釋微球的DMEM培養(yǎng)液)。

1.2.3 鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Τ晒羌?xì)胞生長曲線的影響取生長良好的第3代成骨細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，鏡下計(jì)數(shù)后，以3X103個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板上。用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)液，分別加入實(shí)驗(yàn)分組要求的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)1d、2d、3d、5d、7d、9d后，每日每組取3孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值繪制細(xì)胞生長曲線 (圖3)。鹽酸四環(huán)素緩釋微球作用于第3代大鼠成骨細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后繪制生長曲線 (圖3)顯示:鹽酸四環(huán)素緩釋微球能夠促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞持續(xù)增殖。

1.2.4 MTT法檢測成骨細(xì)胞增殖 取生長良好的第3代成骨細(xì)胞，以每孔4X103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板上，每孔加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液200ul，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，棄去培養(yǎng)液，分別加入實(shí)驗(yàn)分組要求的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)1d、2d、3d、5d、7d、9d后，取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各6孔，每孔加入 MTT(5mg·ml－1)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸盡上清。加150ul DMSO振蕩15min。連續(xù)光譜測讀儀于490nm處測定吸光度 (A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次 (表1)。考察鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Τ晒羌?xì)胞的增殖作用規(guī)律。表1結(jié)果顯示:培養(yǎng)1d后，2組細(xì)胞A值無差異。第2、3d時(shí)，鹽酸四環(huán)素緩釋微球組A值高于空白對(duì)照組，但無顯著性差異 (q檢驗(yàn)，P＞0.05)。第5、7、9d時(shí)，鹽酸四環(huán)素緩釋微球組A值明顯高于空白對(duì)照組，兩組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異 (q檢驗(yàn)，P＜0.01)。

表1 MTT法觀察鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Υ笫蟪晒羌?xì)胞的增殖作用 (A值，±s，n=6)

表1 MTT法觀察鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Υ笫蟪晒羌?xì)胞的增殖作用 (A值，±s，n=6)

A:空白對(duì)照組，B:鹽酸四環(huán)素緩釋微球組。與相同時(shí)間點(diǎn)A組比較，＊＊p＜0.01

組別1d 2d 3d 5d 7d 9d A 0.310±0.013 0.356±0.026 0.385±0.031 0.530±0.032 0.548±0.063 0.503±0.030 B 0.308±0.019 0.423±0.060 0.445±0.053 0.636±0.062＊＊ 0.721±0.051＊＊ 0.733±0.034＊＊

2 討論

四環(huán)素的抗菌特性性質(zhì)用于局部組織中有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和增殖的作用，并有誘導(dǎo)異位成骨的能力[5]。在用復(fù)合鹽酸四環(huán)素的生物衍生骨修復(fù)兔橈骨缺損的研究中發(fā)現(xiàn)，其血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平，修復(fù)區(qū)成骨細(xì)胞和膠原纖維的生成均高于沒有復(fù)合四環(huán)素的對(duì)照組，而且骨愈合也早于對(duì)照組，說明四環(huán)素在骨組織再生過程中可能起到重要作用[6]。四環(huán)素對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究顯示[3]:低濃度四環(huán)素可增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活力，細(xì)胞增殖明顯加快，細(xì)胞的群體倍增時(shí)間縮短。四環(huán)素促進(jìn)骨愈合的機(jī)制，可能源于初始階段的抗菌作用;也可能通過抑制膠原酶的活性使骨的形態(tài)正常，或通過降低破骨細(xì)胞的活性抑制骨吸收，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性刺激膠原的產(chǎn)生，從而促進(jìn)骨再生[7]。為了避免四環(huán)素的突釋現(xiàn)象，滿足骨愈合再生生理學(xué)規(guī)律的要求，持續(xù)促進(jìn)骨生長的作用，將鹽酸四環(huán)素制備成緩釋微球可以滿足促進(jìn)骨生長的要求[4]。經(jīng)研究，鹽酸四環(huán)素緩釋微球能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞持續(xù)增殖比鹽酸四環(huán)素多5～6天，同時(shí)，鹽酸四環(huán)素緩釋微球能顯著增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶的活性和Ⅰ型膠原的表達(dá)[8]。本實(shí)驗(yàn)單從細(xì)胞增殖的角度研究鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)Τ晒羌?xì)胞的增殖活性，從結(jié)果可以看到，鹽酸四環(huán)素緩釋微球?qū)w外培養(yǎng)成骨細(xì)胞具有增殖作用，在骨創(chuàng)傷治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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