葉春美 孫愛(ài)寧

(江蘇省泰興市人民醫(yī)院 江蘇泰興 225400;①蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B－cell Ivmphoma，DLBCL)是最常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤(nonHodgikin，S lymphomas，NHL)，約占成人NHL的30% ～40%。非霍奇金淋巴瘤(NHL)的病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，在此過(guò)程中多個(gè)癌基因激活或抑癌基因失活以及相應(yīng)基因產(chǎn)物的高或低表達(dá)均與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常密切相關(guān)[1]。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞癌變過(guò)程中，Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常變化可能起重要作用，這種變化可由Wnt基因本身或通路任何成分發(fā)生改變而引發(fā)[2]。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要由以下幾種蛋白構(gòu)成:β－連環(huán)素(β－catenin)、APC蛋白(adenomatous polyposiscoli protein)、糖原合成酶激酶 －3β(GSK－3β)及軸蛋白或傳導(dǎo)蛋白(axin)。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)GSK一3β和β －catenin在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究采用免疫組化二步法檢測(cè)PGSK－3β(Ser－9)和β－catenin蛋白在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤、反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，以了解GSK－3β和β－catenin在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤中表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集泰興市人民醫(yī)院2000年9月～2010年9月存檔的DLBCL組織標(biāo)本63例，所有標(biāo)本的病理組織學(xué)類(lèi)型均按2000年WHO的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分型。其中男50例，女13例;年齡13～86歲，平均54.4歲;病變發(fā)生于淋巴結(jié)39例，發(fā)生于結(jié)外24例。所有患者均為初治患者，有明確病理診斷，且通過(guò)體檢、手術(shù)或影像學(xué)檢查確定腫瘤侵犯部位，采用Ann Arbor分期系統(tǒng)。所有人選患者均在我院接受2個(gè)療程以上的聯(lián)合化療CHOP方案，加或不加放療。另外收集14例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織標(biāo)本做為對(duì)照組。采用免疫組化SP二步法檢測(cè)PGSK－3β和β－catenin蛋白在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織中的表達(dá)。

1.2 試劑 β－catenin鼠抗人單克隆抗體、PGSK－3β(Ser－9)兔抗人單克隆抗體、PV26000通用二部法免疫組化檢測(cè)試劑及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 染色方法為二步法免疫組化染色法，β－catenin、PGSK－3β(Ser－9)抗體的工作濃度為1∶50。石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，酒精梯度水化;切片置于10mmol的檸檬酸緩沖液中(pH6.0)煮沸10～20分鐘，室溫下冷卻20分鐘;切片用3%H2O2去離子水孵育5分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次，2分/次;滴加一抗β－catenin或APC，室溫放置60分鐘;PBS沖洗3次，2分/次;加一滴檢測(cè)二抗，室溫放置30分鐘;PBS沖洗3次，2分/次;應(yīng)用DAB溶液顯色5～10分鐘;蘇木素復(fù)染、脫水、封片。

1.4 結(jié)果判斷 每例在顯微鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)淋巴結(jié)細(xì)胞觀察，PGSK－3β(Ser－9)陽(yáng)性染色呈現(xiàn)棕黃色至棕褐色細(xì)小顆粒狀，位于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核。強(qiáng)陽(yáng)性()，中度陽(yáng)性()，弱陽(yáng)性(+)，陰性(－)。為3分，為2分，+為1分，－為0分。β－catenin陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒，位于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核，＞20%腫瘤細(xì)胞核染色陽(yáng)性為陽(yáng)性，強(qiáng)陽(yáng)性()，中度陽(yáng)性()，弱陽(yáng)性(+)，陰性(－)。＜20%的腫瘤細(xì)胞染色或1分視為陰性，和為陽(yáng)性[3]。所有染色經(jīng)兩名醫(yī)生獨(dú)立評(píng)判，若有異議，經(jīng)雙頭鏡共同評(píng)判達(dá)成共識(shí)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用χ2檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β－catenin 定位于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核，彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織β－catenin陽(yáng)性表達(dá)率(28.57%)，反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織(0)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正 χ2=5.220，P ＜0.05)。彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤可見(jiàn)核表達(dá)，表達(dá)率分別為(14.29%)，而反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織未見(jiàn)核表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 β－catenin在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤，反應(yīng)性增生性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)(例)

2.2 PGSK－3β 定位于細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核中，彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織PGSK－3β陽(yáng)性表達(dá)率(38.10%)，反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織陽(yáng)性表達(dá)率(7.14%)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(校正χ2=5.005，P ＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PGSK－3β在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤，反應(yīng)性增生性淋巴結(jié)組織中的表達(dá)(例)

2.3 PGSK－3β和β－catenin陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系 63例彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤中，PGSK－3β(Ser－9)和β－catenin蛋白共同陽(yáng)性18例，6例PGSK－3β陽(yáng)性者，β－catenin蛋白陰性。彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤中PGSK－3β(Ser－9)和β－catenin蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.767，P ＜0.01)。

3 討論

人類(lèi)β－catenin基因定位于染色體的3p2113－22，全長(zhǎng)2312 kb，有16個(gè)外顯子[4]。由β－catenin基因編碼的β－catenin分子量約為92～95kD，含781個(gè)氨基酸殘基[5]，氨基端有GSK－3β的磷酸化位點(diǎn)[6]。β－catenin是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的正向調(diào)節(jié)因素，而APC蛋白、GSK－3β及axin等是負(fù)向調(diào)節(jié)因素[7]。正常成熟細(xì)胞中沒(méi)有Wnt信號(hào)，胞漿內(nèi)的β－catenin大部分與細(xì)胞膜上的鈣粘蛋白E－cadherin結(jié)合，少部分與胞漿內(nèi)APC蛋白、GSK－3β及軸蛋白結(jié)合，三者結(jié)合形成復(fù)合體后，GSK－3β通過(guò)磷酸化可降解β－catenin，因而胞漿內(nèi)游離βcatenin水平極低，不能進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)[8]。在多種因素作用下Wnt信號(hào)異常激活或β－catenin發(fā)生突變，腫瘤細(xì)胞中β－catenin的磷酸化和降解不能正常進(jìn)行，游離的非磷酸化β－catenin在胞漿內(nèi)大量聚積后進(jìn)入核內(nèi)，在核內(nèi)異常蓄積的β－catenin與Tcf/Lef(Tcell transcriptional factor/Lymphoid enhancer factor)形成復(fù)合物，通過(guò)Tcf/Lef核轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)激活相應(yīng)靶基因(如c－myc、cyclin D1等)，引起細(xì)胞增殖和分化失控，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9，10]。本組結(jié)果顯示，β－catenin主要定位于在細(xì)胞漿中，彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)組織 β－catenin陽(yáng)性表達(dá)率(28.57%)，反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織均為陰性表達(dá)，兩者比較，差異顯著(校正 χ2=5.220，P ＜0.05)。彌漫性大 B細(xì)胞性淋巴瘤可見(jiàn)核表達(dá)，表達(dá)率為(14.29%)，而反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織未見(jiàn)核表達(dá)。以上結(jié)果提示β－catenin的陽(yáng)性表達(dá)尤其是細(xì)胞核表達(dá)與彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)。

GSK－3是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是糖元合成酶激酶的限速酶之一，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)GSK－3主要有2種亞型:GSK－3α和GSK－3β，相對(duì)分子質(zhì)量分別為51和47 ku，二者有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和底物，但是功能不同。GSK－3基因有高度保守性，從果蠅到人GSK－3激酶結(jié)構(gòu)域序列上有90%以上同源性。GSK－3α和GSK－3β基因有85%同源性，在催化結(jié)構(gòu)域高達(dá)93%的同源性，二者分別位于19q13.2和3q13.3。GSK－3β基因啟動(dòng)子含有多個(gè)CAAT盒和正負(fù)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)元件。GSK－3β對(duì)底物的識(shí)別與一般激酶不同，GSK－3β底物一般要求有共同的S/TXXXS/T(P)序列，其中x為任意氨基酸，底物磷酸化的發(fā)生首先要在另一個(gè)激酶的作用下使底物S/TXXXS/T(P)序列上C端的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的起始位點(diǎn)引導(dǎo)GSK－3進(jìn)一步使底物磷酸化，形成多位點(diǎn)磷酸化結(jié)構(gòu)域[11]。GSK－3β可磷酸化多種底物，包括參與代謝和信號(hào)調(diào)節(jié)的蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和各種轉(zhuǎn)錄因子，例如糖原合成酶、微管相關(guān)蛋白和β－連環(huán)蛋白等[12]。此外，GSK－3β還影響多種轉(zhuǎn)錄因子如AP－1，β－連環(huán)蛋白，CREB，Myc和 NF－kB等的基因的表達(dá)[13]。GSK－3β活性受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，GSK－3β磷酸化是研究最多的調(diào)節(jié)方式之一，GSK－3βSer－9磷酸化后其活性降低，阻止β－連環(huán)蛋白磷酸化，因此，胞漿內(nèi)β－連環(huán)蛋白含量增加，更多的β－連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合而調(diào)控細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1，e－Myc等多種基因的表達(dá)。這些因子的激活與淋巴瘤、肺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤有關(guān)[14]。在本研究中，我們運(yùn)用免疫組化方法研究pGSK－3β，并綜合評(píng)價(jià)了GSK－3β失活的意義。研究發(fā)現(xiàn)，PGSK－3β主要定位于細(xì)胞漿中，63例彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuse large B－cell lymphoma，DLBCL)中，24例存在GSK－3β失活。14例反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)組織中，僅1例存在GSK－3β失活，兩者比較，差異顯著(校正 χ2=5.005，P ＜0.05)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) pGSK－3β陽(yáng)性與β－catenin陽(yáng)性表達(dá)顯著相關(guān)。總之，我們的數(shù)據(jù)支持GSK－3β在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤發(fā)生機(jī)制中具有重要意義。

以上研究表明，在彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤發(fā)生機(jī)制中，GSK－3βSer－9磷酸化后其活性降低，阻止了β－連環(huán)蛋白磷酸化，胞漿內(nèi)β－連環(huán)蛋白含量增加，更多的β－連環(huán)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活了一系列有關(guān)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)等方面的靶基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致了彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤的發(fā)生。

[1] 許良中.現(xiàn)代惡性淋巴瘤病理學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2002.1 －68

[2] Taketo MM.Shutting down Wnt signal－ activated cancer[J].Nat Genet，2004，36:320

[3] Chung R，Peters A，Armanious H，et al.Biological and clinical significance of GSK－3β in mantle cell lymphoma－an immunohistochemical study[J].Int J Clin Exp Pathol，2010，3(3):244

[4] Nollet F，Berx G，Molemans F，et al.Genomic organization of the humanβ － catenin gene(CTNNB1)[J].Genomics，1996，32:413

[5] Hulsken J，Birchmeier W，Behrens J.E － cadherin and APC compete for the interaction with beta － catenin and the cytoskeleton[J].Cell Biol，1994，127:2061

[6] Pai LM，Orsulic S，Bejsovec A，et al.Negative regulation of armadillo，a wingless effector in drosophila[J].Development，1997，124(11):2255

[7] Kitagawa M，Hatakeyama S，Shirane M，et al.An F － box protein FWD1，mediates ubiquitin－dependent preteolysis of beta－catenin[J].Embo J，1999，18(9):2901

[8] Kishida S，Yamamoto，Iikeada，et al.Axin a negative regulatior of the Wnt signaling pathway，directly interacts with adenomatous polyposis coli and regulates the stablization of beta － catenin[J].Biol Chem，1998，273(18):10823

[9] Hugh TJ，Dillon SA，O＇Doud G，et al.Bata － Catenin expression in primary and metastatic colorectal carcinoma[J].Int J Cancer，1999，82(4):504

[10] Shtutman M，Zhurinsky J，Simcha I，et al.The cyclin D1 gene is a target of the beta － catenin/LEF －1 pathway[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(10):5522

[11] Ali A，Hoeflich KP，Woodgett JR，et al.Glycogen synthase kinase－3:properties，function，and regulation[J].Chem Rev，2001，101(8):2527

[12] Balaraman Y，Limaye AR，Levey AI，et al.Glycogen synthase kinase －3βand Alzheimer＇S disease:pathophysiologcal and therapeutic significance[J].Cell Mol Life Sci，2006，63(11):1226

[13] Darnell JE Jr.Transcription factors an targets for cancer therapy[J].Nat Rev Cancer，2002，2(10):740

[14] Daniel VC，Peacock CD，Watkins DN，et al.Developmental signaling pathwaysinlung cancer[J].Respirology，2006，11(3):234