李揚(yáng)宇，鄭春盛

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350004)

尿紅細(xì)胞檢測的經(jīng)典方法是在顯微鏡下進(jìn)行人工判別。人工鏡檢由于操作繁瑣，效率低下，且存在人工誤差，不適用于常規(guī)尿紅細(xì)胞定量檢測。朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀是將不離心的尿液加入特制的計(jì)數(shù)板中，通過內(nèi)置離心機(jī)以2000r/min離心(半徑6cm)10s，使尿液均勻地沉積于計(jì)數(shù)板底部，然后采用顯微-電荷耦合器件(CCD)攝像技術(shù)對(duì)尿液成分圖像進(jìn)行拍攝，最后通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等多種計(jì)算模型對(duì)尿液成分進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和分類計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。該分析儀性能優(yōu)良，特異性、敏感度等指標(biāo)符合臨床要求，且具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)[1]。本研究通過配制尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液，在去除其它尿有形成分干擾的情況下分析朗邁UriSed分析儀的紅細(xì)胞識(shí)別能力、精密度、攜帶污染率等指標(biāo)。使用隨機(jī)尿液，通過與人工鏡檢法比較評(píng)價(jià)朗邁UriSed分析儀的特異度、敏感度、符合率等指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀及配套尿沉渣計(jì)數(shù)板(匈牙利77Elektronika公司)；普通雙目生物顯微鏡(日本Olympus公司)；一次性尿沉渣計(jì)數(shù)板(北京恒瑞天創(chuàng)機(jī)電設(shè)備有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞的制備 選擇福建省血液中心提供的濾白洗滌紅細(xì)胞樣本1份，用血細(xì)胞分析儀(用美國雅培公司提供的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)，批號(hào)為L5023，N5023，H5023)測量紅細(xì)胞數(shù)值，使用正常人混合尿液(收集多人尿液，用高速離心方法除去細(xì)胞成分，留取上清液)將濾白洗滌紅細(xì)胞配制成濃 度 為 l000/μl、500/μl、250/μl、125/μl、62.5/μl、31.3/μl、15.6/μl和 7.8/μl的標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 標(biāo)本來源 隨機(jī)收集我院門診患者晨尿120例。

1.4 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀法 嚴(yán)格按儀器說明書操作步驟對(duì)每份充分混勻的尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測，記錄檢測結(jié)果。

1.5 人工鏡檢定量計(jì)數(shù)法 不離心鏡檢計(jì)數(shù)法：將混勻尿液滴入一次性尿沉渣計(jì)數(shù)板內(nèi)，靜置片刻。先在低倍視野下觀察細(xì)胞的分布情況，再在高倍視野下計(jì)數(shù)l0個(gè)大方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)。離心鏡檢計(jì)數(shù)法：將10ml尿液標(biāo)本倒入一次性尿沉渣管，充分混勻。以1500r/min，離心5min，吸去上清液，留取0.2ml沉渣，用一次性吸管輕輕混勻后，滴入一次性尿沉渣計(jì)數(shù)板內(nèi)，靜置片刻，先在低倍視野下觀察細(xì)胞的分布情況，再在高倍視野下計(jì)數(shù)l0個(gè)大方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)。離心后尿液標(biāo)本的紅細(xì)胞數(shù) (紅細(xì)胞數(shù)/μl)=10個(gè)大方格的紅細(xì)胞數(shù)/濃縮倍數(shù)。在標(biāo)本配制后2h內(nèi)完成所有檢測。

1.6 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀尿紅細(xì)胞識(shí)別能力 各濃度尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液分別檢測6次，分別記錄分析儀測試紅細(xì)胞數(shù)(R0)，分析儀測試誤檢數(shù) (主要為尿白細(xì)胞W0)、分析儀測試總細(xì)胞數(shù)(R0+W0)，人工識(shí)別紅細(xì)胞數(shù)(R1)。分別計(jì)算誤識(shí)率[W0/(R0+W0)]、漏檢率[(R1-(R0+W0))/R1]和識(shí)別率(R0/R1)。隨機(jī)標(biāo)本用分析儀檢測，記錄分析儀測試紅細(xì)胞數(shù)(R0)，人工識(shí)別紅細(xì)胞數(shù)(R1)，計(jì)算識(shí)別率(R0/R1)。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，比對(duì)分析儀對(duì)尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液與隨機(jī)尿液紅細(xì)胞的識(shí)別率間的差異。

1.7 精密度試驗(yàn) 由于自動(dòng)成像技術(shù)為原理的尿沉渣質(zhì)控品不易標(biāo)準(zhǔn)化，本次試驗(yàn)采用紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行批內(nèi)精密度評(píng)價(jià)。選取高、中、低濃度尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液各一份，使用分析儀對(duì)同一份標(biāo)本重復(fù)測定20次，分析其批內(nèi)精密度。結(jié)果以變異系數(shù)(CV)表示。

1.8 線性試驗(yàn) 將各紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液的檢測值與理論值進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.9 互染率試驗(yàn) 取高濃度尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)本及混合尿液標(biāo)本各一份(每份分3管)，隨機(jī)配對(duì)。用分析儀連續(xù)檢測高濃度標(biāo)本3次(H1，H2，H3)，隨后連續(xù)檢測混合尿液標(biāo)本3次，得細(xì)胞數(shù)(L1，L2，L3)，然后按下面公式計(jì)算互染率。互染率(%)＝|L1-L3|/(H3-L3)×100%。

1.10 人工鏡檢參考方法的選擇 各濃度尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液分別用朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀法，不離心鏡檢法、離心鏡檢法檢測尿紅細(xì)胞6次。朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀法記錄人工識(shí)別結(jié)果。分別計(jì)算三種方法的平均值、與理論濃度間的偏差。用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比對(duì)理論濃度與三種方法結(jié)果，選擇人工鏡檢參考方法。

1.11 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 將隨機(jī)的120例門診晨尿標(biāo)本分成兩份，1份用分析儀檢測，記錄人工識(shí)別結(jié)果。1份使用不離心鏡檢法檢測，一次性專用數(shù)板參考值[2]：0~4.5/μl記為陰性，≥4.5/μl記為陽性。 以人工鏡檢為參考，評(píng)價(jià)分析儀準(zhǔn)確性。記錄兩種方法均為陽性標(biāo)本數(shù)(TP)，兩種方法均為陰性的標(biāo)本數(shù)(TN)，不離心法陽性，分析儀法陰性的標(biāo)本數(shù)(FN)，不離心法陰性，分析儀法陽性標(biāo)本數(shù)(FP)。計(jì)算靈敏度＝TP/(TP+FN)×100%； 特異性＝TN/(TN+FP)×100%；陽性預(yù)測值＝TP/(TP+FP)×100%；陰性預(yù)測值＝TN/(TN+FN)×100%； 符合率＝(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)×100%。

1.12 比對(duì)試驗(yàn) 采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，比對(duì)尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液與隨機(jī)門診尿液不離心鏡檢法與分析儀法的檢測結(jié)果。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀尿紅細(xì)胞識(shí)別能力評(píng)價(jià)結(jié)果 尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液濃度為(0-1000)/μl時(shí)，尿紅細(xì)胞的漏檢率與濃度的關(guān)系不大，濃度為 62.5/μl時(shí)最高，1000/μl時(shí)最低； 尿紅細(xì)胞的誤檢率隨著濃度的降低而增高；除濃度62.5/μl外，尿紅細(xì)胞的識(shí)別率隨著濃度的降低而降低。尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液的總體識(shí)別率為49.8%，隨機(jī)尿液的總體識(shí)別率為：44.1%。兩者經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，Z＝-0.328，P>0.05，兩者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀尿紅細(xì)胞識(shí)別能力

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 分析儀高、中、低值檢測結(jié)果的批內(nèi)精密度結(jié)果。見表2。

表2 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀批內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性分析結(jié)果 將尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液的測定值與理論值進(jìn)行回歸分析，回歸方程為Y=0.92X+1.34，相關(guān)系數(shù) r＝0.999。

2.4 互染率試驗(yàn)結(jié)果 不同濃度尿紅細(xì)胞之間的互染率，見表3。

2.5 人工鏡檢參考方法選擇結(jié)果 經(jīng)比較，離心鏡檢結(jié)果與理論濃度之間偏差最大，不離心鏡檢、分析儀結(jié)果較接近理論濃度。見表4。經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)不離心鏡檢結(jié)果與理論濃度之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；分析儀、離心鏡檢結(jié)果與理論濃度間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不離心鏡檢與分析儀結(jié)果間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；離心鏡檢與分析儀檢測結(jié)果之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。因此選擇不離心鏡檢做為準(zhǔn)確性試驗(yàn)與比對(duì)試驗(yàn)的參考方法。

表3 朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀互染率試驗(yàn)結(jié)果(個(gè)/μl)

表4 三種方法紅細(xì)胞檢測結(jié)果(x±s，個(gè)/μl)

表5 三種方法尿紅細(xì)胞檢測結(jié)果與理論濃度經(jīng)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果

2.6 準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果 以不離心鏡檢法為參考，分析儀法的靈敏度為84.0%；特異性為94.3%；陽性預(yù)示值為91.3%；陰性預(yù)示值為89.2%；符合率為90.0%；見表6。

表6 兩種方法尿紅細(xì)胞檢驗(yàn)方法結(jié)果比較

2.7 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果 由于健康成人尿紅細(xì)胞呈偏態(tài)分布[3]，本試驗(yàn)采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液不離心鏡檢法與分析儀法的檢測結(jié)果：Z=-1.262，P>0.05，兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨機(jī)尿液標(biāo)本不離心鏡檢法與分析儀法的檢測結(jié)果：Z=-2.060，P＝0.039，P<0.05，兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀是近幾年來新興的具有自動(dòng)識(shí)別功能、提供清晰全景視野圖的新型尿液有形成分分析儀。該儀器具有操作簡單，運(yùn)行成本低，結(jié)果直觀可視、可控、攜帶污染率低等優(yōu)點(diǎn)。其分析結(jié)果具有圖像的可視性，對(duì)有些不能正確識(shí)別的有形成分可通過人工識(shí)別加以辨認(rèn)和結(jié)果修正，可以得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀的尿紅細(xì)胞自動(dòng)識(shí)別理論是基于人工網(wǎng)絡(luò)自適應(yīng)共振理論，可以逼真地模擬生物神經(jīng)系統(tǒng)，依靠神經(jīng)元之間的興奮、協(xié)調(diào)以及抑制、競爭的作用來進(jìn)行信息處理，可以模擬人腦的穩(wěn)定性與可塑性，擁有學(xué)過不忘和不斷積累的能力。一般情況下，經(jīng)過訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以很好地對(duì)尿沉渣中的各有形成分進(jìn)行識(shí)別，但是未經(jīng)訓(xùn)練或是分析儀識(shí)別軟件未及時(shí)更新升級(jí)時(shí)，分析儀的識(shí)別能力不是很理想。當(dāng)遇到不規(guī)則成分重疊、粘連等情況時(shí)，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)往往無法給出正確的識(shí)別結(jié)果。另外，由于泌尿系統(tǒng)疾病或其它原因可以引起尿沉渣成分的畸變，部分有形成分的形態(tài)特征可能發(fā)生變化[4]，還有一些圖像光照不均勻[5]影響分析儀的自動(dòng)識(shí)別。本研究表明，無其它有形成分干擾下，尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液濃度為(0~1000)/μl時(shí)，尿紅細(xì)胞的漏檢率與濃度的關(guān)系不大，尿紅細(xì)胞的誤檢率隨著濃度的降低而增高；尿紅細(xì)胞的識(shí)別率隨著濃度的降低而降低。尿紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)液的總體識(shí)別率為49.8%，隨機(jī)尿液的總體識(shí)別率為44.1%，兩者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析儀的紅細(xì)胞識(shí)別能力不很理想。

雖然分析儀的紅細(xì)胞識(shí)別率不理想，但是分析儀的分析圖像具有可視性，我們可以根據(jù)圖像對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行人工修正。人工修正后，分析儀尿紅細(xì)胞檢測結(jié)果的批內(nèi)精密度與國內(nèi)外同類產(chǎn)品如AVE-764B尿液有形成份分析儀[6]，F(xiàn)US-100全自動(dòng)尿沉渣分析儀[7]結(jié)果較一致，在中高濃度時(shí)CV值較低，低濃度時(shí)CV值較高，這是由于低濃度時(shí)，尿紅細(xì)胞細(xì)胞不能均勻的分布到每一個(gè)檢測區(qū)域。 在線性分析方面，r=0.999表明尿紅細(xì)胞在(0~1000)/μl范圍內(nèi)線性良好，能滿足絕大多數(shù)臨床標(biāo)本的要求。在互染率方面，根據(jù)國內(nèi)外報(bào)告，以自動(dòng)鏡檢成像技術(shù)為原理的尿沉渣分析的互染率均較其它類型的尿沉渣分析儀理想。本次試驗(yàn)?zāi)蚣t細(xì)胞的互染率為0%，能夠滿足臨床要求。

在準(zhǔn)確度方面，目前人工鏡檢法仍是臨床上尿紅細(xì)胞判定的金標(biāo)準(zhǔn)，但是離心后鏡檢由于部分細(xì)胞未能離心至管底、部分細(xì)胞在離心時(shí)被破壞、離心后的沉渣未混勻、計(jì)數(shù)的細(xì)胞在計(jì)數(shù)池內(nèi)的分布誤差、細(xì)胞黏附試管管壁、計(jì)算結(jié)果時(shí)要除以濃縮系數(shù)等原因不適用于尿紅細(xì)胞定量檢測。本次研究表明不離心鏡檢法能更準(zhǔn)確反映尿紅細(xì)胞的實(shí)際濃度，更適合作為人工鏡檢的參考方法，與叢玉隆等人的研究相符[8]。采用不離心鏡檢作為參考方法，分析儀法與不離心鏡檢法之間有較高的符合率。比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果，無其它有形成分干擾的情況下，分析儀法與不離心鏡檢法結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨機(jī)尿中，分析儀法與不離心鏡檢法結(jié)果之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成以上結(jié)果的原因可能是：叢玉隆等人采用的是不離心多樣品量的細(xì)胞計(jì)數(shù)，擴(kuò)大紅細(xì)胞計(jì)數(shù)范圍，如果采用此方法可能會(huì)得出較理想的結(jié)果，但是由于操作過于繁瑣，不適用于臨床尿紅細(xì)胞定量復(fù)檢。不離心鏡檢法可能受到細(xì)胞成分分布不均、人工主觀因素等影響。此外，隨機(jī)尿中尿有形成分復(fù)雜，在實(shí)際工作中，尿液標(biāo)本的存放時(shí)間、尿紅細(xì)胞經(jīng)腎臟或泌尿道擠壓等破壞、尿液比重過低、尿pH值偏高、尿液標(biāo)本收集容器受到消毒劑污染，真菌、脂肪滴、結(jié)晶等被誤判為紅細(xì)胞，菌尿等都會(huì)干擾分析儀對(duì)尿紅細(xì)胞的判定[9-11]。因此尿液標(biāo)本檢測前應(yīng)重視標(biāo)本分析前質(zhì)量控制[12]能在一定程序上提高分析儀的識(shí)別能力，減少人工識(shí)別。

綜上所述，朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀能自動(dòng)快速檢測，所需的樣品量少，可以提高工作效率，雖然未經(jīng)訓(xùn)練的分析儀對(duì)紅細(xì)胞的識(shí)別不理想，但是分析結(jié)果的圖像具有可視性，可以通過人工識(shí)別加以辨認(rèn)和結(jié)果修正，修正后的結(jié)果能滿足臨床要求。分析儀還能夠經(jīng)過訓(xùn)練和軟件升級(jí)不斷提高分析儀的識(shí)別率。分析儀尿紅細(xì)胞檢測與不離心鏡檢法也具有較高的符合率。雖然在隨機(jī)尿液中，分析儀檢測結(jié)果與不離心鏡檢法結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是由于尿紅細(xì)胞定量檢測目前沒有真正意義上的金標(biāo)準(zhǔn)，不離心鏡檢本身也存在許多影響因素，此統(tǒng)計(jì)結(jié)果并不能說明朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀真實(shí)檢測的準(zhǔn)確性。在對(duì)檢測標(biāo)本進(jìn)行人工識(shí)別前提下，朗邁UriSed全自動(dòng)尿沉渣分析儀能夠?yàn)榕R床標(biāo)本的高通量檢測提供可靠的質(zhì)量保證[13]，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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