譚雪蓮 ，姜朝新 ，王柱紅 ，莊錫偉 ，龔道元 ，李子萍

(1、佛山市南海區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 佛山 528244；2、佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院，廣東 佛山 528244；3、佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528244)

不孕不育是影響人類生殖健康的重要問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，育齡夫婦一年內(nèi)不能懷孕者占25%，其中15%尋求治療，男方因素引起不育占50%。男性不育患者的數(shù)量在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)，這與生活節(jié)奏的加快、環(huán)境污染的危害和人為不良行為的影響造成了精子數(shù)量、質(zhì)量的降低，男性生殖功能下降等因素有關(guān)。關(guān)于男性不育的病因和發(fā)病機(jī)制研究已成為男性科學(xué)中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。近年來(lái)，氧化應(yīng)激在生殖及發(fā)育中的作用越來(lái)越受到關(guān)注[2],目前關(guān)于活性氧 (reactwe oxygen Species，ROS)產(chǎn)生增加引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致男性不育的文獻(xiàn)報(bào)道較多[3，4]，但國(guó)內(nèi)關(guān)于抗氧化系統(tǒng)對(duì)男性不育的影響報(bào)道不多。對(duì)氧磷酶-1(Paraoxonase-1，PON-1)是人體內(nèi)重要的抗氧化酶，可減輕或抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激，與男性不育密切相關(guān)[5]。本研究通過(guò)測(cè)定男性不育患者精漿PON-1活性，探討精液中PON-1活性測(cè)定在男性不育癥患者診斷中的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組 男性不育癥組42例，均來(lái)自佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院男性科不育門(mén)診就診的男性不育癥患者，年齡 22～36歲，平均 (27.0±4.5)歲，婚后性生活正常，未避孕2年以上不育，無(wú)外傷及遺傳性疾病家族史，無(wú)性功能障礙病史，體檢未發(fā)現(xiàn)有明顯睪丸、附睪及輸精管異常，女方生育能力經(jīng)檢驗(yàn)排除異常。健康對(duì)照組50例，來(lái)自有子女的自愿獻(xiàn)精者，年齡24～38歲，平均 (27.5±4.7)歲。

1.2 主要儀器與試劑 分光光度計(jì)(日本島津UV-210A型)，WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)(南昌新長(zhǎng)征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))；乙酸苯酯為瑞典百靈威公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 精液標(biāo)本采集與處理 精液標(biāo)本采集：所選受試者禁欲2～7d，于醫(yī)院處置室內(nèi)手淫取精，置干燥無(wú)菌量杯內(nèi)，37℃水浴箱內(nèi)液化，并記錄液化時(shí)間。精漿標(biāo)本制備：精液以3000r/min離心15min,取上層精漿于-40℃保存待測(cè)。

1.3.2 精子密度、活力等常規(guī)指標(biāo)測(cè)定 采用國(guó)產(chǎn)WLJY-9000型偉力彩色精子質(zhì)量分析系統(tǒng)測(cè)定精子密度、活力等指標(biāo)。

1.3.3 精子形態(tài)檢查 按照WHO標(biāo)準(zhǔn)采用改良巴氏染色法進(jìn)行染色,用國(guó)產(chǎn)WLJY-9000型偉力彩色精子形態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)下人工修正方法進(jìn)行精子形態(tài)分析。為提高準(zhǔn)確率,同一份精液標(biāo)本需2位專業(yè)檢測(cè)人員進(jìn)行形態(tài)分析。

1.3.4 精漿PON-1活性測(cè)定 采用分光光度法測(cè)定PON-1活性，操作如下：反應(yīng)緩沖液(0.1mol/L的Tris-HCl 緩 沖 液 中 ，2.0mmol/L CaCl2，pH=8.0)1.3ml，加入 5mmol/L 的乙酸苯酯 150μl，于 25℃水浴預(yù)溫20min后，加入1:10倍稀釋的樣本50μl反應(yīng)90s，用0.5mol/L的EDTA液100μl終止反應(yīng)。然后用分光光度計(jì)于270nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。同時(shí)設(shè)立精液對(duì)照和底物對(duì)照。酶活性計(jì)算公式如下：PON-1 活性 (kU/L)=A×103×f×FV/(t×SV×L×ε)，式中A為凈吸光度值(即標(biāo)本吸光度值－精液對(duì)照和底物對(duì)照的吸光度值)，f為標(biāo)本稀釋倍數(shù)，F(xiàn)V為反應(yīng)終體積，t為反應(yīng)時(shí)間，SV為樣品體積，L為光徑，ε為摩爾消光系數(shù)，酶的活性單位定義為每分鐘催化1μmol乙酸苯酯水解所需的酶量為1 U。

1.3.5 ROC曲線對(duì)疾病診斷價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn) 參考《臨床檢驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)》[6]。ROC曲線下面積(AUC)在﹥0.5的情況下，AUC越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好。AUC在0.5～0.7時(shí)，診斷價(jià)值較低；AUC在0.7～0.9時(shí)，有一定診斷價(jià)值；AUC﹥0.9時(shí)，診斷價(jià)值較高。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包,計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男性不育組與對(duì)照組精漿PON-1活性及其他參數(shù)測(cè)定結(jié)果比較 男性不育組精子濃度、精子活動(dòng)力、正常精子形態(tài)明顯高于對(duì)照組，精漿PON-1明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 男性不育組與對(duì)照組精液參數(shù)結(jié)果比較(x±s)

2.2 精索靜脈曲張組、白細(xì)胞精子癥組與對(duì)照組精漿PON-1活性測(cè)定結(jié)果比較 精索靜脈曲張組精漿PON-1明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，白細(xì)胞精子癥組精漿PON-1明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，白細(xì)胞精子癥組精漿PON-1明顯低于精索靜脈曲張組 (P＜0.01)，結(jié)果見(jiàn)表 2。

表2 精索靜脈曲張組、白細(xì)胞精子癥組與對(duì)照組PON-1結(jié)果比較(x±s)

2.3 精漿PON-1活性的ROC曲線分析結(jié)果 應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)精漿PON-1活性檢測(cè)結(jié)果處理，繪制出PON-1的ROC曲線，并計(jì)算ROC曲線下面積 AUC(area under curve)。PON-1的 AUC為0.907，處理結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，可見(jiàn)PON-1曲線下面積較大。

3 討論

ROS是機(jī)體組織正常有氧代謝產(chǎn)物，具有比氧更為活躍的化學(xué)反應(yīng)，1989年Aitken等首先提出少量的ROS在生理狀況下可調(diào)節(jié)精子功能[7]，研究表明少量ROS是精子獲能、增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)和精卵融合以及發(fā)生頂體反應(yīng)所必須。但產(chǎn)生過(guò)多可引起氧化應(yīng)激，繼而導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)和功能損傷，使精子過(guò)早發(fā)生頂體反應(yīng)、精子活力降低、受精異常，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡和DNA損傷等[8]。正常情況下男性生殖道中抗氧化酶系統(tǒng)和非酶性抗氧化物成分使活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡[9]，當(dāng)生殖系統(tǒng)ROS產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力降低會(huì)導(dǎo)致平衡失調(diào)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。PON-1是人體肝臟產(chǎn)生的存在于高密度脂蛋白分子中的一種重要的抗氧化酶，可水解脂質(zhì)過(guò)氧化物，可阻止低密度脂蛋白氧化，減少脂質(zhì)氧化產(chǎn)物聚集及酶解清除氧化產(chǎn)物等效應(yīng)發(fā)揮抗氧化作用。當(dāng)機(jī)體ROS產(chǎn)生過(guò)多或PON-1生成過(guò)少，導(dǎo)致氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，產(chǎn)生精子氧化應(yīng)激損傷，可以導(dǎo)致男性不育[2]。研究證實(shí)[10]精漿中PON-1活性降低是男性不育的危險(xiǎn)因素，因此，精漿PON-1活性有望成為診斷男性不育的一種新的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

Verit FF等[10]研究發(fā)現(xiàn)精漿中PON-1活性與精子數(shù)量、精子活動(dòng)性和精子形態(tài)學(xué)改變高度相關(guān)，PON-1活性降低是男性不育的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn),男性不育組精漿PON-1活性明顯低于健康對(duì)照組，男性不育組精子濃度、活力和正常形態(tài)明顯低于對(duì)照組，男性不育組精漿PON-1活性和精子常規(guī)檢驗(yàn)參數(shù)精子濃度、活力和正常形態(tài)呈平行關(guān)系，結(jié)果提示，精漿PON-1活性測(cè)定對(duì)男性不育癥診斷具有較大臨床價(jià)值。

Ozdamar等發(fā)現(xiàn)[11]，精索靜脈曲張時(shí)，ROS生成增加，引起氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激也會(huì)消耗過(guò)多的PON-1，導(dǎo)致精漿PON-1活性降低。本研究結(jié)果證實(shí)，精索靜脈曲張組精漿PON-1活性明顯低于對(duì)照組。本研究結(jié)果顯示，白細(xì)胞精子癥組精漿中PON-1水平明顯低于對(duì)照組和靜脈曲張組，可能的原因是，白細(xì)胞精子癥ROS產(chǎn)生顯著增加，消耗更多的PON-1，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，引起氧化應(yīng)激導(dǎo)致男性不育[12]。提示精漿PON-1活性測(cè)定對(duì)男性不育的診斷具有重要臨床價(jià)值。通過(guò)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)精漿PON-1 ROC曲線下面積為0.907，大于0.9，對(duì)男性不育癥的診斷價(jià)值較高。

綜上所述，精漿中PON-1活性測(cè)定為男性不育癥診斷和療效觀察提供參考依據(jù)，具有較大臨床價(jià)值。

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