胡雪飛 ，胡慶宏 ，李俊明 ，朱帆

(1、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006；2、武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

1961年英國(guó)的JEVONS首次發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)[1]，70年代末MRSA急劇增多遍及全球,耐藥范圍日益擴(kuò)大,耐藥程度日益嚴(yán)重，80年代后期MRSA已成為全球性的病原菌[1],檢出率達(dá)60%~80%。由于MRSA對(duì)多種抗菌藥物具有廣泛耐藥性，可用的僅為萬(wàn)古霉素等糖肽類(lèi)抗菌藥物。到20世紀(jì)90年代后期又出現(xiàn)了耐萬(wàn)古霉素的MRSA[2，3]，表明金黃色葡萄球菌現(xiàn)已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集我院2009年1月至12月分離的甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌共260株，菌株來(lái)自各臨床科室住院和門(mén)診患者。

1.2 菌株分離與鑒定 按《全國(guó)檢驗(yàn)操作規(guī)程(第3版)》進(jìn)行。用全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)VITEK 2 COMPACT儀及配套的藥敏卡AST-P535進(jìn)行鑒定和MRSA檢測(cè)。

1.3 基因檢測(cè)

1.3.1 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)；Tran2K DNA Marker DI 2000:2000、1000、750、500、250、100(bp);Lysozyme 葡萄球菌溶菌酶和2×Easy Taq PCR SuperMix,5ML,AS111 (均由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供);根據(jù)GenBanK中發(fā)布的各型基因序列設(shè)計(jì)引物，mecA基因擴(kuò)增引物 M1:5’ -AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3’(533bp)，M2:5’ -AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3’和qacA基因的PCR擴(kuò)增引物，Q1:5’-GCTGCATTTATGACAATGTTTG -3’ (629bp)，Q2:5’ -AATCCCACCTACTAAAGCAG-3’(均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供)。

1.3.2 DNA模板制備 隨機(jī)選擇50株MRSA，進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取,取0.5~2ml培養(yǎng)菌液(最多不超過(guò)2×108個(gè)細(xì)胞),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。提取的DNA模板放-20℃冰箱保存。

1.3.3 mecA基因檢測(cè) PCR反應(yīng)體系2×Easy Taq PCR SuperMix 25μl,引物 M1(20μM)1μl,引物 M2(20μM)1μl,DNA 模板 3μl,ddH2O 20μl, 總體積50μl；93℃2min，93℃1min，55℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃2min，終止。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳 (100V)，時(shí)間為30min,然后在JY04S型凝膠成像儀下觀(guān)察、記錄結(jié)果并拍照。

1.3.4 qacA基因檢測(cè) PCR反應(yīng)體系2×Easy Taq PCR SuperMix 25μl,引物 M1(20μM)1μl,引物 M2(20μM)1μl,DNA 模板 3μl,ddH2O 20μl, 總體積50μl；93℃2min，93℃30s，55℃30s，72℃60s，35 個(gè)循環(huán)，72℃5min，終止。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100V)，時(shí)間為30min,然后在JY04S型凝膠成像儀下觀(guān)察、記錄結(jié)果并拍照。

1.3.5 基因測(cè)序 50份標(biāo)本中隨機(jī)抽取24份標(biāo)本進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，其中41號(hào)、43號(hào)與13號(hào)三株測(cè)序失敗，剩余21份標(biāo)本測(cè)序順利。

2 結(jié)果

2.1 MRSA的菌株收集 2009年1月至12月共分離金黃色葡萄球菌260株，其中MRSA140株，占53.8%。

2.2 mecA基因檢測(cè)結(jié)果 共檢測(cè)MRSA 50株，mecA基因陽(yáng)性株50株，陽(yáng)性率為100%。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳圖 見(jiàn)圖1。

圖1 MRSAmceA基因擴(kuò)增結(jié)果

2.2.2 mecA基因測(cè)序結(jié)果 21份標(biāo)本測(cè)序結(jié)果與GENBANK上的MRSA mecA基因組序列(NCBI序列號(hào)：NC_002952)進(jìn)行比對(duì)，相似性均為99%-100%。21份標(biāo)本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為mecA基因，表明21個(gè)菌株均為mecA基因陽(yáng)性菌株,見(jiàn)表1。

表1 21株測(cè)序結(jié)果分別與GENBANK上MRSA mecA基因組比對(duì)結(jié)果

2.3 qacA基因檢測(cè)結(jié)果 共檢測(cè)MRSA 50株，未檢測(cè)到qacA基因陽(yáng)性株。見(jiàn)圖2。

圖2 MRSAqacA 基因擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

本研究MRSA檢出率為53.8%，高于陳燕等的研究結(jié)果[4]，MRSA的耐藥性來(lái)源是由于mecA基因編碼的PBP2α的耐藥性,PBP2α為葡萄球菌青霉素結(jié)合蛋白2(PBP2)的異構(gòu)體,在大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的治療劑量范圍內(nèi)PBPs必須(PBPs分為 4 種,PBP1、2、3、4) 與藥物結(jié)合而失活，但PBP2α不與藥物結(jié)合而保持活性，繼續(xù)行使其功能，從而顯示耐藥性[5，6]。攜帶mecA基因或苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌為MRSA,本研究50株MRSA菌,分子生物學(xué)檢測(cè)mecA基因均為陽(yáng)性,陽(yáng)性率為100%，且21株測(cè)序結(jié)果與GenBank上的MRSAmecA基因組序列 (NC_002952)分別進(jìn)行比對(duì)，相似性均為99%或100%，表明21個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為mecA基因，兩者非常一致。和孫靜娜等的研究結(jié)果一致[7]。結(jié)果也說(shuō)明了金黃色葡萄球菌對(duì)β-內(nèi)酰氨類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制重要的是mecA基因編碼的PBP2α導(dǎo)致對(duì)甲氧西林/苯唑西林耐藥,而mecA檢測(cè)陰性的三種耐藥機(jī)制發(fā)生率很低[8]。

一項(xiàng)來(lái)自13個(gè)亞洲國(guó)家,共894株MRSA有關(guān)消毒劑敏感性,和抗性基因qacA/B和smr基因研究結(jié)果表明，qacA/B陽(yáng)性率為41.6%(372/894)，smr陽(yáng)性率為3.13%(28/894)，前者陽(yáng)性率顯著高于后者,提示亞洲地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌qacA/B是消毒劑耐藥最重要的基因[9]。國(guó)內(nèi)王華麗等[10]研究84株MRSA的qacA基因陽(yáng)性株4株，168株MSSA的qacA基因陽(yáng)性株1株，周庭權(quán)等[11]研究126株金黃色葡萄球菌MRSA 52株，檢測(cè)出qacA基因陽(yáng)性12株，MSSA74株,未檢測(cè)到qacA基因陽(yáng)性株。上述研究均說(shuō)明MRSA的qacA基因陽(yáng)性檢出率明顯高于MSSA,然而，我們檢測(cè)的50株MRSA均未攜帶qacA基因，可能與各個(gè)醫(yī)院消毒劑使用方法和地區(qū)差異有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

為了控制耐藥型金黃色葡萄球菌的傳播，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)醫(yī)務(wù)人員的培訓(xùn)與指導(dǎo)，使之掌握金黃色葡萄球菌的感染消毒、隔離、防護(hù)及合理使用抗菌藥物，選用和合理使用消毒劑，加強(qiáng)終末消毒。

[1]Eriksen KR.Celbenin:resistant staphylococcui[M].Ugeskr Laeger,1961,123(2):384-386.

[2]CDC.Staphylococcus aureus with reduced suscep tibility to vancomycin-Llinois,1999[J].Morb Mortal Wkly Rep，2000，48(51):1165-1167.

[3]CDC.Staphylococcus aureus resistant to vancomyc in United States,2002[J].MMWR,2002,51(23):565-567.

[4]陳燕.132株金黃色葡萄球菌的耐藥性分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(6):641.

[5]楊清宇.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2004,14(2):478-480.

[6]Sakulas G,Gold HS,Venkataraman L,et al.methicillin-resistant Staphylococcus aureus:comparison of susceptibility testing methods and analysis of mecA-positive susceptible strains[J].J Clin Microbiol,2001,39(11):3946-3951.

[7]孫靜娜,張征,張衛(wèi)國(guó),等.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌相關(guān)耐藥基因及耐消毒劑基因qacA的檢測(cè) [J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009，18(22)：2630-2631，2644.

[8]倪語(yǔ)星,韓立中主譯,陳民鈞主審.抗菌藥物臨床應(yīng)用-從抗菌譜到臨床處方[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:61-62.

[9]Noguchin N,Suwa J,Narui K,et al,Susceptibilities to antiseptic agents and distribution of antiseptic-resistance genes qacA/B and smr of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolated in Asia during 1998 and 1999[J].J Med Microbiol,2005,54(6):557-565.

[10]王華麗,盛家琦,黃文祥,等.金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因qacA的研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2007,32(4):229-231.

[11]周庭權(quán),黃文祥,賈蓓,等.金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因qacA的流行病學(xué)研究[J].中國(guó)感染與化療雜志,2009,9(4):283-285.