鄧林強，陳益國，陳會

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

隨著對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌感染病例的出現(xiàn)，并且這類細菌呈多重耐藥甚至全耐藥表型，給臨床治療帶來相當大的困難。替加環(huán)素(Tigecycline)是第一種應用于臨床的新型甘氨酰環(huán)素類抗生素，是在米諾環(huán)素9位分子上添加叔丁基甘氨酰胺基團后形成的米諾環(huán)素衍生物[1]。由于抗菌譜廣，尤其對一些多耐藥革蘭陰性菌具有強大的抗菌作用，目前已成為治療碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染的新選擇。我國臨床微生物實驗室采用美國臨床和實驗室標準化協(xié)會 (CLSI)制定的指南進行藥敏試驗，目前該指南并沒有替加環(huán)素的藥敏折點判斷標準和操作指南[2]。此外，國內使用的以肉湯稀釋法為基礎的自動化藥敏儀的藥敏板也多數(shù)不包含替加環(huán)素。如何進行替加環(huán)素體外藥敏試驗，給臨床提供相應治療依據(jù)成為現(xiàn)實問題。為此，我們對本院分離的23株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌同時采用紙片擴散法和MIC測試條(MIC Test Strip，MTS)法測定其對替加環(huán)素的敏感性，比較分析，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 23株肺炎克雷伯菌分離自我院2012年8月至2013年8月間住院患者的臨床標本。其中SICU 16株，器官移植科1株，神經(jīng)外科和呼吸內科各3株。

1.2 菌株鑒定及體外藥敏試驗 23株肺炎克雷伯菌均經(jīng)BD Phoenix100全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)進行鑒定和藥敏，操作嚴格按說明進行。

1.3 碳青霉烯酶表型確證試驗 改良Hodge試驗：將0.5麥氏濁度的大腸埃希菌 ATCC25922稀釋10倍后涂布至M-H平板上,將亞胺培南紙片貼于平板中央,從藥敏紙片邊緣向平板邊緣劃待測菌,35°C孵育16~18h觀察結果，亞胺培南抑菌圈內待測菌呈矢狀生長現(xiàn)象即為產(chǎn)酶菌。雙紙片協(xié)同試驗：采用亞胺培南、EDTA 1500μg兩種紙片進行K-B法藥物敏感性測定，兩紙片相距10~15mm，在含EDTA紙片方向處，亞胺培南抑菌圈直徑擴大，即可判定產(chǎn)金屬酶。

1.4 替加環(huán)素體外藥敏試驗 替加環(huán)素的紙片擴散法和MTS法藥敏試驗嚴格按照CLSI M2-A9進行，并對紙片擴散法平行檢測3次，計算平均值為最終結果；判讀標準參照美國FDA的標準及文獻[3]。 即 MIC≤2μg/ml為敏感、4μg/ml為中介、≥8μg/ml為耐藥，抑菌環(huán)直徑≤14mm為耐藥、15~18mm為中介、≥19mm為敏感。替加環(huán)素的藥敏紙片購自英國OXOID公司；MIC測試條(MTS)購自意大利Liofilchem 公司，濃度梯度為 0.016~256μg/ml；Difco MHA購自美國BD公司。

1.5 兩種方法相關性判定標準 以MTS法為標準，判定紙片擴散法的結果。嚴重誤差：MTS耐藥，紙片擴散法敏感；重要誤差：MTS敏感，紙片擴散法耐藥；次要誤差：MTS耐藥或敏感，紙片擴散法中介。各誤差率的計算方法參照文獻[4]。

1.6 質量控制 質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

2 結果

2.1 產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的敏感性 見表1。

表1 產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐藥性

2.2 兩種方法檢測替加環(huán)素對產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的敏感性應用MTS法檢測敏感率達100%；而用紙片擴散法敏感率為95.7%，并出現(xiàn)4.3%的中介菌株。若以MTS法為標準，應用紙片擴散法檢測次要誤差率為4.3%，無重要誤差和嚴重誤差。

3 討論

我院自2012年出現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染病例以來，呈現(xiàn)蔓延趨勢，且主要集中在SICU、神經(jīng)外科等免疫力低下患者相對集中的病區(qū)。本文收集的23株產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌呈多重耐藥甚至全耐藥表型，對12種臨床常用藥物耐藥率達100%，僅對復方新諾明和四環(huán)素的敏感率較高，分別為87.0%和78.3%(表1)，給臨床治療帶來相當大的困難。

替加環(huán)素于2012年在中國上市，目前已有用于治療泛耐藥革蘭陰性桿菌的報道[5，6]。替加環(huán)素的體外藥敏試驗包括紙片擴散法、稀釋法、儀器法、E-test和MTS法。其中，肉湯稀釋法被認為是檢測替加環(huán)素敏感性的金標準[7]，但該方法操作繁瑣；法國生物梅里埃公司的Vitek 2系統(tǒng)ASTGN16卡(目前僅有自動化儀器法)和E-test法檢測MIC值高于肉湯稀釋法的檢測結果[8]；MTS法檢測替加環(huán)素的體外藥物敏感率與肉湯稀釋法具有很好的一致性，同時該方法操作簡單，很容易應用于臨床[9]，但成本較高，不適合作為臨床常規(guī)檢測的開展。本文選用Difco MHA同時進行紙片擴散法和MTS法檢測替加環(huán)素對產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的敏感性，結果的判讀參照美國FDA的標準及文獻。結果顯示應用MTS法檢測的敏感率達100%，而用紙片擴散法敏感率為95.7%，出現(xiàn)4.3%的中介菌株。若以MTS法為標準，則紙片擴散法檢測的次要誤差率為4.3%,無重要誤差和嚴重誤差。紙片擴散法是目前臨床使用最廣泛的體外藥敏試驗方法之一，操作簡便且成本較低，但易受多種因素的影響，如接種菌量、預溫育時間、抗生素含量及擴散能力、瓊脂厚度等。已有研究表明[10]，紙片擴散法可能高估替加環(huán)素的中介率和耐藥率。本文結果中出現(xiàn)的4.3%次要誤差可能與此有關。但誤差率比國內報導低[11],除了可能與本次受檢樣本數(shù)量較少和菌株克隆數(shù)單一有關外，試驗采用不同的 MH 瓊脂[12，13](Mn2+和/或 Mg2+濃度不同)可能也是誤差率不同的另一原因。

因此，對產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌進行替加環(huán)素的敏感性測定時，檢測方法的不同可能會出現(xiàn)藥敏結果的不一致。在解釋藥敏結果時需注意所選用的試驗方法，對于紙片擴散法檢測非敏感菌株最好能應用MTS法復核，避免誤差，為臨床合理用藥提供可靠的依據(jù)。

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