鄧林強，陳益國，陳會

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

隨著對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌感染病例的出現，并且這類細菌呈多重耐藥甚至全耐藥表型，給臨床治療帶來相當大的困難。替加環(huán)素(Tigecycline)是第一種應用于臨床的新型甘氨酰環(huán)素類抗生素，是在米諾環(huán)素9位分子上添加叔丁基甘氨酰胺基團后形成的米諾環(huán)素衍生物[1]。由于抗菌譜廣，尤其對一些多耐藥革蘭陰性菌具有強大的抗菌作用，目前已成為治療碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌感染的新選擇。我國臨床微生物實驗室采用美國臨床和實驗室標準化協會 (CLSI)制定的指南進行藥敏試驗，目前該指南并沒有替加環(huán)素的藥敏折點判斷標準和操作指南[2]。此外，國內使用的以肉湯稀釋法為基礎的自動化藥敏儀的藥敏板也多數不包含替加環(huán)素。如何進行替加環(huán)素體外藥敏試驗，給臨床提供相應治療依據成為現實問題。為此，我們對本院分離的23株碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌同時采用紙片擴散法和MIC測試條(MIC Test Strip，MTS)法測定其對替加環(huán)素的敏感性，比較分析，結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 23株肺炎克雷伯菌分離自我院2012年8月至2013年8月間住院患者的臨床標本。其中SICU 16株，器官移植科1株，神經外科和呼吸內科各3株。

1.2 菌株鑒定及體外藥敏試驗 23株肺炎克雷伯菌均經BD Phoenix100全自動細菌鑒定藥敏系統(tǒng)進行鑒定和藥敏，操作嚴格按說明進行。

1.3 碳青霉烯酶表型確證試驗 改良Hodge試驗：將0.5麥氏濁度的大腸埃希菌 ATCC25922稀釋10倍后涂布至M-H平板上,將亞胺培南紙片貼于平板中央,從藥敏紙片邊緣向平板邊緣劃待測菌,35°C孵育16~18h觀察結果，亞胺培南抑菌圈內待測菌呈矢狀生長現象即為產酶菌。雙紙片協同試驗：采用亞胺培南、EDTA 1500μg兩種紙片進行K-B法藥物敏感性測定，兩紙片相距10~15mm，在含EDTA紙片方向處，亞胺培南抑菌圈直徑擴大，即可判定產金屬酶。

1.4 替加環(huán)素體外藥敏試驗 替加環(huán)素的紙片擴散法和MTS法藥敏試驗嚴格按照CLSI M2-A9進行，并對紙片擴散法平行檢測3次，計算平均值為最終結果；判讀標準參照美國FDA的標準及文獻[3]。 即 MIC≤2μg/ml為敏感、4μg/ml為中介、≥8μg/ml為耐藥，抑菌環(huán)直徑≤14mm為耐藥、15~18mm為中介、≥19mm為敏感。替加環(huán)素的藥敏紙片購自英國OXOID公司；MIC測試條(MTS)購自意大利Liofilchem 公司，濃度梯度為 0.016~256μg/ml；Difco MHA購自美國BD公司。

1.5 兩種方法相關性判定標準 以MTS法為標準，判定紙片擴散法的結果。嚴重誤差：MTS耐藥，紙片擴散法敏感；重要誤差：MTS敏感，紙片擴散法耐藥；次要誤差：MTS耐藥或敏感，紙片擴散法中介。各誤差率的計算方法參照文獻[4]。

1.6 質量控制 質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

2 結果

2.1 產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌對常用抗菌藥物的敏感性 見表1。

表1 產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的耐藥性

2.2 兩種方法檢測替加環(huán)素對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的敏感性應用MTS法檢測敏感率達100%；而用紙片擴散法敏感率為95.7%，并出現4.3%的中介菌株。若以MTS法為標準，應用紙片擴散法檢測次要誤差率為4.3%，無重要誤差和嚴重誤差。

3 討論

我院自2012年出現產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染病例以來，呈現蔓延趨勢，且主要集中在SICU、神經外科等免疫力低下患者相對集中的病區(qū)。本文收集的23株產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌呈多重耐藥甚至全耐藥表型，對12種臨床常用藥物耐藥率達100%，僅對復方新諾明和四環(huán)素的敏感率較高，分別為87.0%和78.3%(表1)，給臨床治療帶來相當大的困難。

替加環(huán)素于2012年在中國上市，目前已有用于治療泛耐藥革蘭陰性桿菌的報道[5，6]。替加環(huán)素的體外藥敏試驗包括紙片擴散法、稀釋法、儀器法、E-test和MTS法。其中，肉湯稀釋法被認為是檢測替加環(huán)素敏感性的金標準[7]，但該方法操作繁瑣；法國生物梅里埃公司的Vitek 2系統(tǒng)ASTGN16卡(目前僅有自動化儀器法)和E-test法檢測MIC值高于肉湯稀釋法的檢測結果[8]；MTS法檢測替加環(huán)素的體外藥物敏感率與肉湯稀釋法具有很好的一致性，同時該方法操作簡單，很容易應用于臨床[9]，但成本較高，不適合作為臨床常規(guī)檢測的開展。本文選用Difco MHA同時進行紙片擴散法和MTS法檢測替加環(huán)素對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的敏感性，結果的判讀參照美國FDA的標準及文獻。結果顯示應用MTS法檢測的敏感率達100%，而用紙片擴散法敏感率為95.7%，出現4.3%的中介菌株。若以MTS法為標準，則紙片擴散法檢測的次要誤差率為4.3%,無重要誤差和嚴重誤差。紙片擴散法是目前臨床使用最廣泛的體外藥敏試驗方法之一，操作簡便且成本較低，但易受多種因素的影響，如接種菌量、預溫育時間、抗生素含量及擴散能力、瓊脂厚度等。已有研究表明[10]，紙片擴散法可能高估替加環(huán)素的中介率和耐藥率。本文結果中出現的4.3%次要誤差可能與此有關。但誤差率比國內報導低[11],除了可能與本次受檢樣本數量較少和菌株克隆數單一有關外，試驗采用不同的 MH 瓊脂[12，13](Mn2+和/或 Mg2+濃度不同)可能也是誤差率不同的另一原因。

因此，對產碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌進行替加環(huán)素的敏感性測定時，檢測方法的不同可能會出現藥敏結果的不一致。在解釋藥敏結果時需注意所選用的試驗方法，對于紙片擴散法檢測非敏感菌株最好能應用MTS法復核，避免誤差，為臨床合理用藥提供可靠的依據。

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