孔令和，柯云霞，高素香，楊劍，雷桂萍，史國香，黃潔

(九江市第三醫(yī)院，江西 九江332000)

結核病是一種嚴重危害人民健康的慢性傳染病，據(jù)WHO統(tǒng)計，全球有約20億人感染結核分枝桿菌，每年約為200萬死于結核病[1]。我國是世界上僅次于印度的第2個結核病大國，結核感染率為44.5%，活動性結核患者450萬，每年死亡人數(shù)達13萬[2]。目前在結核病方面，臨床實驗室常用檢測的方法是有：涂片抗酸染色法、培養(yǎng)法、實時熒光PCR(TB-DNA)檢測、結核抗體和結核菌素試驗等。由于涂片抗酸染色陽性率低，結核分枝桿菌培養(yǎng)的檢測時間較長等原因，都無法很好地服務于臨床。所以尋求準確、快速、可靠的診斷結核病方法非常重要。

近年來研究表明IFN-γ是抗結核感染免疫中的關鍵細胞因子[3]，主要由激活的T淋巴細胞在結核特異性抗原刺激下產(chǎn)生。T-SPOT.TB診斷實驗以BCG以及大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌中均缺失，僅存在于堪薩斯分枝桿菌及海分枝桿菌等少數(shù)環(huán)境分枝桿菌中的RD1基因合成的抗原靶-6(ESAT-6)及蛋白-10(CFP-10)作為刺激抗原[4],結核分枝桿菌感染外周血單個核淋巴細胞(PBMC)中存在結核特異性T細胞，T淋巴細胞受到結核桿菌特異性抗原刺激后分泌IFN-γ。我們應用此方法對臨床患者相關標本進行了檢測，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集我院自2012年11月至2013年5月在肺、呼吸兩科住院疑診或待排結核病的患者，共273例，資料較完整有169例，其中男性115例，女性54例，年齡在2~81歲，平均年齡為55.3歲。進行了T-SPOT.TB方法檢測。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 T-SPOT.TB試劑盒，淋巴細胞分離液、AIM、RPM1640培養(yǎng)液由上海長征復星公司提供。

1.2.2 美國Thermo Formo生物安全柜、Galaxy Rs-Biotech CO2孵育箱、Neofuge 1600R型臺式高速水平離心機、

1.3 原理 T-SPOT.TB技術是利用結核分枝桿菌感染外周血單個核淋巴細胞(PBMC)中存在結核特異性T細胞，這個T淋巴細胞受到結核桿菌特異性抗原刺激后分泌IFN-γ。PBMC和結核特異的混合抗原A(ESAT-6)和混合抗原B(CFP-10)與對照試劑一起加入預包被干擾素抗體的微孔板進行培養(yǎng)孵育。當PBMC中存在特異性T細胞時，培養(yǎng)液中加入的結核分枝桿菌特異混合抗原多肽A和多肽B將刺激其分泌。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ捕獲，再次加入的堿性磷酸酶標記抗體與被捕獲的IFN-γ相結合，滯留在微孔板上，加入顯色底物溶液在反應部位形成不溶性色素沉著斑點。每1個斑點代表1個結核分枝桿菌致敏的T淋巴細胞，根據(jù)斑點數(shù)可以判斷體內(nèi)是否存在針對結核分枝桿菌反應的效應T淋巴細胞，并可計數(shù)T細胞的數(shù)量。

1.4 方法 (1)采集4ml外周血置于肝素鈉抗凝的試管中(2管)，立即混勻，在4h內(nèi)進行單個核細胞(PBMC)分離。(2)離心管中預先加入4mlRPM1640培養(yǎng)液，將混勻的8ml抗凝全血加入離心管中，混勻。(3)另取一離心管預先加入4ml淋巴細胞分離液，將混勻的細胞懸液緩慢加入淋巴細胞分離液上方，經(jīng)1600g離心22min,再用吸管吸取白細胞層到15ml的離心管中。(4)再加入RPM1640培養(yǎng)液至10ml,600g離心7min,棄去上清液。(5)再加RPM1640培養(yǎng)液至10ml,400g離心7min,棄去上清液。(6)加0.5ml AIM培養(yǎng)液，充分混勻。取10μl細胞懸液于40μl臺盼蘭中混勻，再用細胞計數(shù)板充池計數(shù)(或直接使用血球儀計數(shù))。每份標本用AIM培養(yǎng)液配制為2.5×109個/L，再取出T-SPOT.TB試劑盒內(nèi)微孔反應板，每個樣本按 (陰性對照、A抗原、B抗原、陽性對照)的順序加入相應的50μl試劑，然后每空加入100μl細胞稀釋工作液后孵育，37℃，5%CO2，16~20h， 用 pH6.8~7.2 的 PBS 洗板。加入堿性磷酸酶標記的抗人IFN-γ單克隆抗體50μl,2~8℃孵育1h。再用PBS液洗板，最后每孔加顯色液50μl。避光室溫靜置7min，用蒸餾水沖洗后觀察結果。并用電子放大鏡觀察記錄斑點數(shù)。

1.5 結果判斷 依據(jù)試劑盒內(nèi)所說明的判斷標準進行，陰性斑點數(shù)為0~5個，抗原A和抗原B檢測孔數(shù)－陰性孔數(shù)≥6判斷為陽性。如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6時，檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性對照孔斑點數(shù)則判斷為陽性。

2 結果

2.1 273例結果的分析 采用T-SPOT.TB方法共檢測臨床疑診或待排結核患者共273例，資料較完整共169例，對169例患者還同時進行了TST、涂片找抗酸桿菌、TB-DNA、分枝桿菌分離培養(yǎng)的檢測，并通過影像學、病理組織穿刺、PCR技術、涂片找抗酸桿菌等相關檢查且結合臨床癥狀而確診結核性疾病共107例(其中1例肝結核是在上海某醫(yī)院行肝組織穿刺明確診斷)，占63.31%。其中肺結核82例，淋巴結核18例、骨結核4例、腎結核1例、肝結核1例、睪丸結核1例；非結核呼吸道疾病患者62例，占36.68%。其中包括肺部感染42例、支氣管擴張12例、肺癌5例、自發(fā)性氣胸2例、慢性阻塞性肺氣腫1例。在結核性疾病中所有肺結核患者都行痰涂片找抗酸桿菌檢測，42例患者行分枝桿菌分離培養(yǎng)，53例患者行TB-DNA檢測；在非結核呼吸道疾病中45例患者行痰涂片找抗酸桿菌檢測，19例患者行分枝桿菌分離培養(yǎng)，32例患者行TB-DNA檢測。兩組患者臨床資料見表1。

表1 兩組患者臨床資料

2.2 169例陽性結果的分析 169例T-SPOT.TB陽性檢測結果與其他結核診斷檢驗的比較檢測陽性率見表2。

表2 169例T-SPOT.TB檢測結果與其他結核診斷檢驗的比較

3 討論

目前，最簡單、最常用的診斷方法是通過涂片染色直接觀察抗酸桿菌，但這種方法靈敏性很差，對于結核桿菌感染者其檢出率只有在30%左右，60%以上的肺結核患者及75%的肺外結核都不能夠通過這種方法檢測出來，并且該方法僅能夠做到分枝桿菌屬(85%為結核分枝桿菌，15%非結核分枝桿菌)的鑒定，而無法確定致病菌就是結核桿菌。結核診斷的金標準細菌培養(yǎng)法則一般需要4~8周的時間才能得出結果，并且受到較多干擾因素的影響，陽性檢出率仍低于30%，難以滿足快速、準確診斷的需要[6]。結核菌素實驗是臨床常用的篩查結核的方法，因操作簡單、快速，在臨床上使用廣泛，但對于感染結核2周之內(nèi)、近期免疫受抑制的患者，特別是合并人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、重癥疾病者、年幼兒童及營養(yǎng)不良、器官移植者，缺乏足夠的靈敏度[7]。這使得結核菌素實驗在結核病診斷應用中受到限制。聚合酶鏈反應(PCR)為結核病的快速診斷開辟了新途徑，但由于假陽性較高影響了結果的可靠性，其臨床應用受到了限制。諸多因素制約了結核病的診斷。對于感染結核分枝桿菌的患者進行早期診斷和治療是改善預后的關鍵，也是控制結核播散的重要環(huán)節(jié)。尋找一種靈敏度和特異度都較高的診斷方法以提高結核病的確診率已成當務之急。近年來，一些國家和地區(qū)將TSPOT.TB試驗用來作為結核病輔助診斷，相關報道日益增多。我院自2012年11月起引進T-SPOT.TB試驗用于臨床結核病的診斷，從表2中可以看到，確診結核性疾病共107例(其中包括肺結核，淋巴結核、骨結核、腎結核、肝結核、睪丸結核)；陽性率是83.1%(89/107)，特異性為95.2%，與韋海旭等報道一致[5]。其他結核檢驗結果分別為結核菌素實驗TST 40.2%(43/107)、涂片找抗酸桿菌檢測25.6%(21/82)、 分 枝 桿 菌 分 離 培 養(yǎng) 21.4%(9/42)、TBDNA9.4%(5/53)(由于取材較困難)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，由此可見其敏感性明顯高于其它常規(guī)檢測方法。在非結核呼吸道疾病患者62例中(其中包括肺癌、自發(fā)性氣胸、肺部感染、支氣管擴張、慢性阻塞性肺氣腫等)T-SPOT.TB方法的陽性3例，占 4.8%(3/62)，陰性 59 例，占 95.2%(59/62)、TST 的陽性率27.4%(17/62)、但涂片找抗酸桿菌檢測了45例，檢出率為0%(0/45)、TB-DNA的陽性率0%(0/32)(由于取材較困難)、分枝桿菌分離培養(yǎng)陽性率是0%(0/19)。

綜上所述T-SPOT.TB試驗用于臨床結核病的診斷，相對簡單、快速，24~48h即能得出結果，能夠早期提供靈敏、特異的結核感染依據(jù)。對于結核分枝桿菌診斷，該試驗方法值得廣泛應用于臨床。

[1]李明武,賴明紅,劉永莉,等.結核分枝桿菌感染T細胞斑點實驗在肺外結核病中的診斷價值[J].中華臨床感染雜志,2012,5(4):235-237.

[2]蘇俊華,朱莉莉,陳建華,保凌,等.T淋巴細胞斑點實驗在結核病診斷中的應用[J].中國感染與化療雜志,2010,10(4):297-299.

[3]馮經(jīng)華,尹鳳鳴,嚴振球.目前結核分支桿菌感染中重要免疫細胞和細胞因子作用的研究進展[J].臨床軍醫(yī)雜志,2007,35(3):291-295.

[4]監(jiān)士寧,瞿介明.T-SPOT.TB在結核病診斷中的應用價值[J].國際呼吸雜志,2012,32(6):439-442.

[5]韋海旭,席危蓮,陸利歡,等.γ-干擾素釋放反析 T-Spot.TB在結核性疾病中的診斷價值[J].臨床肺科雜志,2012,17(8):1439-1440.

[6]王永生,徐小雅,楊華.等.T-SPOT.TB試劑盒在結核性胸膜炎臨床診斷中的價值[J].四川醫(yī)學,2011,32(12):1854-1856.

[7]布紅麗,智霞萍,張嬌月.結核分枝桿菌效應T細胞斑點實驗在臨床快速診斷結核病中的應用 [J].中國藥物與臨床,2012,12(7):848-850.