孔令和，柯云霞，高素香，楊劍，雷桂萍，史國(guó)香，黃潔

(九江市第三醫(yī)院，江西 九江332000)

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球有約20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年約為200萬(wàn)死于結(jié)核病[1]。我國(guó)是世界上僅次于印度的第2個(gè)結(jié)核病大國(guó)，結(jié)核感染率為44.5%，活動(dòng)性結(jié)核患者450萬(wàn)，每年死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)[2]。目前在結(jié)核病方面，臨床實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)的方法是有：涂片抗酸染色法、培養(yǎng)法、實(shí)時(shí)熒光PCR(TB-DNA)檢測(cè)、結(jié)核抗體和結(jié)核菌素試驗(yàn)等。由于涂片抗酸染色陽(yáng)性率低，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)等原因，都無(wú)法很好地服務(wù)于臨床。所以尋求準(zhǔn)確、快速、可靠的診斷結(jié)核病方法非常重要。

近年來(lái)研究表明IFN-γ是抗結(jié)核感染免疫中的關(guān)鍵細(xì)胞因子[3]，主要由激活的T淋巴細(xì)胞在結(jié)核特異性抗原刺激下產(chǎn)生。T-SPOT.TB診斷實(shí)驗(yàn)以BCG以及大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌中均缺失，僅存在于堪薩斯分枝桿菌及海分枝桿菌等少數(shù)環(huán)境分枝桿菌中的RD1基因合成的抗原靶-6(ESAT-6)及蛋白-10(CFP-10)作為刺激抗原[4],結(jié)核分枝桿菌感染外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC)中存在結(jié)核特異性T細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞受到結(jié)核桿菌特異性抗原刺激后分泌IFN-γ。我們應(yīng)用此方法對(duì)臨床患者相關(guān)標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集我院自2012年11月至2013年5月在肺、呼吸兩科住院疑診或待排結(jié)核病的患者，共273例，資料較完整有169例，其中男性115例，女性54例，年齡在2~81歲，平均年齡為55.3歲。進(jìn)行了T-SPOT.TB方法檢測(cè)。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 T-SPOT.TB試劑盒，淋巴細(xì)胞分離液、AIM、RPM1640培養(yǎng)液由上海長(zhǎng)征復(fù)星公司提供。

1.2.2 美國(guó)Thermo Formo生物安全柜、Galaxy Rs-Biotech CO2孵育箱、Neofuge 1600R型臺(tái)式高速水平離心機(jī)、

1.3 原理 T-SPOT.TB技術(shù)是利用結(jié)核分枝桿菌感染外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC)中存在結(jié)核特異性T細(xì)胞，這個(gè)T淋巴細(xì)胞受到結(jié)核桿菌特異性抗原刺激后分泌IFN-γ。PBMC和結(jié)核特異的混合抗原A(ESAT-6)和混合抗原B(CFP-10)與對(duì)照試劑一起加入預(yù)包被干擾素抗體的微孔板進(jìn)行培養(yǎng)孵育。當(dāng)PBMC中存在特異性T細(xì)胞時(shí)，培養(yǎng)液中加入的結(jié)核分枝桿菌特異混合抗原多肽A和多肽B將刺激其分泌。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ捕獲，再次加入的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體與被捕獲的IFN-γ相結(jié)合，滯留在微孔板上，加入顯色底物溶液在反應(yīng)部位形成不溶性色素沉著斑點(diǎn)。每1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞，根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)可以判斷體內(nèi)是否存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，并可計(jì)數(shù)T細(xì)胞的數(shù)量。

1.4 方法 (1)采集4ml外周血置于肝素鈉抗凝的試管中(2管)，立即混勻，在4h內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)分離。(2)離心管中預(yù)先加入4mlRPM1640培養(yǎng)液，將混勻的8ml抗凝全血加入離心管中，混勻。(3)另取一離心管預(yù)先加入4ml淋巴細(xì)胞分離液，將混勻的細(xì)胞懸液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上方，經(jīng)1600g離心22min,再用吸管吸取白細(xì)胞層到15ml的離心管中。(4)再加入RPM1640培養(yǎng)液至10ml,600g離心7min,棄去上清液。(5)再加RPM1640培養(yǎng)液至10ml,400g離心7min,棄去上清液。(6)加0.5ml AIM培養(yǎng)液，充分混勻。取10μl細(xì)胞懸液于40μl臺(tái)盼蘭中混勻，再用細(xì)胞計(jì)數(shù)板充池計(jì)數(shù)(或直接使用血球儀計(jì)數(shù))。每份標(biāo)本用AIM培養(yǎng)液配制為2.5×109個(gè)/L，再取出T-SPOT.TB試劑盒內(nèi)微孔反應(yīng)板，每個(gè)樣本按 (陰性對(duì)照、A抗原、B抗原、陽(yáng)性對(duì)照)的順序加入相應(yīng)的50μl試劑，然后每空加入100μl細(xì)胞稀釋工作液后孵育，37℃，5%CO2，16~20h， 用 pH6.8~7.2 的 PBS 洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IFN-γ單克隆抗體50μl,2~8℃孵育1h。再用PBS液洗板，最后每孔加顯色液50μl。避光室溫靜置7min，用蒸餾水沖洗后觀察結(jié)果。并用電子放大鏡觀察記錄斑點(diǎn)數(shù)。

1.5 結(jié)果判斷 依據(jù)試劑盒內(nèi)所說(shuō)明的判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，陰性斑點(diǎn)數(shù)為0~5個(gè)，抗原A和抗原B檢測(cè)孔數(shù)－陰性孔數(shù)≥6判斷為陽(yáng)性。如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)，檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)則判斷為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 273例結(jié)果的分析 采用T-SPOT.TB方法共檢測(cè)臨床疑診或待排結(jié)核患者共273例，資料較完整共169例，對(duì)169例患者還同時(shí)進(jìn)行了TST、涂片找抗酸桿菌、TB-DNA、分枝桿菌分離培養(yǎng)的檢測(cè)，并通過(guò)影像學(xué)、病理組織穿刺、PCR技術(shù)、涂片找抗酸桿菌等相關(guān)檢查且結(jié)合臨床癥狀而確診結(jié)核性疾病共107例(其中1例肝結(jié)核是在上海某醫(yī)院行肝組織穿刺明確診斷)，占63.31%。其中肺結(jié)核82例，淋巴結(jié)核18例、骨結(jié)核4例、腎結(jié)核1例、肝結(jié)核1例、睪丸結(jié)核1例；非結(jié)核呼吸道疾病患者62例，占36.68%。其中包括肺部感染42例、支氣管擴(kuò)張12例、肺癌5例、自發(fā)性氣胸2例、慢性阻塞性肺氣腫1例。在結(jié)核性疾病中所有肺結(jié)核患者都行痰涂片找抗酸桿菌檢測(cè)，42例患者行分枝桿菌分離培養(yǎng)，53例患者行TB-DNA檢測(cè)；在非結(jié)核呼吸道疾病中45例患者行痰涂片找抗酸桿菌檢測(cè)，19例患者行分枝桿菌分離培養(yǎng)，32例患者行TB-DNA檢測(cè)。兩組患者臨床資料見(jiàn)表1。

表1 兩組患者臨床資料

2.2 169例陽(yáng)性結(jié)果的分析 169例T-SPOT.TB陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果與其他結(jié)核診斷檢驗(yàn)的比較檢測(cè)陽(yáng)性率見(jiàn)表2。

表2 169例T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果與其他結(jié)核診斷檢驗(yàn)的比較

3 討論

目前，最簡(jiǎn)單、最常用的診斷方法是通過(guò)涂片染色直接觀察抗酸桿菌，但這種方法靈敏性很差，對(duì)于結(jié)核桿菌感染者其檢出率只有在30%左右，60%以上的肺結(jié)核患者及75%的肺外結(jié)核都不能夠通過(guò)這種方法檢測(cè)出來(lái)，并且該方法僅能夠做到分枝桿菌屬(85%為結(jié)核分枝桿菌，15%非結(jié)核分枝桿菌)的鑒定，而無(wú)法確定致病菌就是結(jié)核桿菌。結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌培養(yǎng)法則一般需要4~8周的時(shí)間才能得出結(jié)果，并且受到較多干擾因素的影響，陽(yáng)性檢出率仍低于30%，難以滿足快速、準(zhǔn)確診斷的需要[6]。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)是臨床常用的篩查結(jié)核的方法，因操作簡(jiǎn)單、快速，在臨床上使用廣泛，但對(duì)于感染結(jié)核2周之內(nèi)、近期免疫受抑制的患者，特別是合并人類免疫缺陷病毒(HIV)感染、重癥疾病者、年幼兒童及營(yíng)養(yǎng)不良、器官移植者，缺乏足夠的靈敏度[7]。這使得結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)在結(jié)核病診斷應(yīng)用中受到限制。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為結(jié)核病的快速診斷開辟了新途徑，但由于假陽(yáng)性較高影響了結(jié)果的可靠性，其臨床應(yīng)用受到了限制。諸多因素制約了結(jié)核病的診斷。對(duì)于感染結(jié)核分枝桿菌的患者進(jìn)行早期診斷和治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵，也是控制結(jié)核播散的重要環(huán)節(jié)。尋找一種靈敏度和特異度都較高的診斷方法以提高結(jié)核病的確診率已成當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，一些國(guó)家和地區(qū)將TSPOT.TB試驗(yàn)用來(lái)作為結(jié)核病輔助診斷，相關(guān)報(bào)道日益增多。我院自2012年11月起引進(jìn)T-SPOT.TB試驗(yàn)用于臨床結(jié)核病的診斷，從表2中可以看到，確診結(jié)核性疾病共107例(其中包括肺結(jié)核，淋巴結(jié)核、骨結(jié)核、腎結(jié)核、肝結(jié)核、睪丸結(jié)核)；陽(yáng)性率是83.1%(89/107)，特異性為95.2%，與韋海旭等報(bào)道一致[5]。其他結(jié)核檢驗(yàn)結(jié)果分別為結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)TST 40.2%(43/107)、涂片找抗酸桿菌檢測(cè)25.6%(21/82)、 分 枝 桿 菌 分 離 培 養(yǎng) 21.4%(9/42)、TBDNA9.4%(5/53)(由于取材較困難)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，由此可見(jiàn)其敏感性明顯高于其它常規(guī)檢測(cè)方法。在非結(jié)核呼吸道疾病患者62例中(其中包括肺癌、自發(fā)性氣胸、肺部感染、支氣管擴(kuò)張、慢性阻塞性肺氣腫等)T-SPOT.TB方法的陽(yáng)性3例，占 4.8%(3/62)，陰性 59 例，占 95.2%(59/62)、TST 的陽(yáng)性率27.4%(17/62)、但涂片找抗酸桿菌檢測(cè)了45例，檢出率為0%(0/45)、TB-DNA的陽(yáng)性率0%(0/32)(由于取材較困難)、分枝桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性率是0%(0/19)。

綜上所述T-SPOT.TB試驗(yàn)用于臨床結(jié)核病的診斷，相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，24~48h即能得出結(jié)果，能夠早期提供靈敏、特異的結(jié)核感染依據(jù)。對(duì)于結(jié)核分枝桿菌診斷，該試驗(yàn)方法值得廣泛應(yīng)用于臨床。

[1]李明武,賴明紅,劉永莉,等.結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)在肺外結(jié)核病中的診斷價(jià)值[J].中華臨床感染雜志,2012,5(4):235-237.

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