胡芹，涂智杰，吳集才，魏建萍，張敏，曹健

(景德鎮(zhèn)市疾病預(yù)防控制中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

手足口病是一種常見及輕微但傳染度頗高的傳染病，可由多種腸道病毒引起。此病多發(fā)生于5歲以下兒童，可引起手、足、口腔、臀部等部位的皰疹，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，進(jìn)而危及生命[1]。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中以柯薩奇病毒A組16型(CA16)和腸道病毒71型(EV71)最為常見。本實驗室自2009年開展此病的病原學(xué)監(jiān)測以來，每年都有臨床重癥病例，甚至包括死亡病例送檢。為了解景德鎮(zhèn)地區(qū)重癥病例臨床癥狀差異性形成的生物學(xué)基礎(chǔ)，本實驗室采集2例手足口臨床癥狀有差異性的重癥標(biāo)本進(jìn)行生物信息學(xué)分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2011年景德鎮(zhèn)市珠山區(qū)疾控中心采集的 2例重癥手足口咽拭子標(biāo)本(2011JDZ35,2011JDZ202)，其中1例出現(xiàn)明顯神經(jīng)癥狀，1例未出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，-80oC保存。

1.2 病毒分離與鑒定 RD細(xì)胞由江西省疾病預(yù)防控制中心疾病檢驗所提供；EV71病毒分離與鑒定按《手足口病預(yù)防控制指南》(2009版)操作規(guī)程進(jìn)行：標(biāo)本接種RD細(xì)胞，置于36℃培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng) CPE 達(dá)＋＋＋～＋＋＋＋時收獲，并通過RT-PCR進(jìn)行鑒定[2]。

1.3 病毒RNA的提取及基因測序 采用QIAGEN公司的Rneasy mini Kit，按照試劑盒說明書操作。取病毒培養(yǎng)液上清液200μl提取RNA,最終收集RNA提取液30μl。使用Promega公司的M-MLV試劑盒制備病毒的cDNA。根據(jù)本實驗室已有引物[3]，使用TaKaRa LA Taq試劑盒完成相應(yīng)片段的PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)膠回收后送上海捷瑞公司進(jìn)行測序。使用DNAstar軟件包中的SeqMan對序列片段進(jìn)行拼接、編輯、校正。將2011JDZ35與2011JDZ202株與GenBank登錄的國內(nèi)外不同地域并具有不同基因型的12個EV71病毒株作為參考株，并選擇Cox.A16(G10)為外群，用Mega5.1 Beta2軟件采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)進(jìn)行序列分析，Bootstrap值設(shè)定為1000，獲得VP1區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹并對其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析 2例手足口重癥病例都由EV71病毒引起，2株EV71病毒株(2011JDZ35,2011JDZ202)全基因組核苷酸序列已被GenBank數(shù)據(jù)庫收錄，GenBank登錄編號分別為JQ806378和KC109780。2.2病毒基因親緣進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示本地實驗株與近幾年來流行于內(nèi)地的毒株親緣關(guān)系較近，同屬于C4a亞型，并且景德鎮(zhèn)2011JDZ35與安徽阜陽株EU703812為同一遺傳分支、2011JDZ202與浙江寧波株2011NB65為另一遺傳分支[4，5]。 見圖 1。

圖1 EV71 VP1編碼區(qū)核苷酸遺傳進(jìn)化分析

2.3 VP1氨基酸序列比對 2011JDZ35有兩個位點發(fā)生明顯變異，第19位丙氨酸由纈氨酸取代(A→V)，第 106位酪氨酸由苯丙氨酸取代 (Y→F)。2011JDZ202有三個位點發(fā)生明顯變異，第19位丙氨酸由半胱氨酸取代(A→C)，第38位精氨酸由谷氨酰胺取代(R→Q)，第293位丙氨酸由絲氨酸取代(A→S)。具體結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 2011JDZ202 VP1區(qū)protein blast結(jié)果

圖3 2011JDZ35 VP1區(qū)protein blast結(jié)果

3 討論

手足口病是冬春季節(jié)兒童的多發(fā)病，由于疾病初起時癥狀不明顯易被家長忽視，而一旦病情耽誤極易惡化，逐漸發(fā)展成重癥病例。伴隨神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)還可能造成病兒的死亡。本實驗室所檢測的重癥病例都由EV71病毒引起，由此可見EV71病毒在手足口病的防控工作中不容忽視。

EV71病毒的VP1基因全長891bp，其編碼蛋白位于病毒外膜蛋白的最外面，因此VP1蛋白是EV71主要的病毒中和決定因子，具有與病毒血清型相對應(yīng)的遺傳多樣性，是基因分型和遺傳進(jìn)化分析的重要研究對象[6]。而且VP1蛋白對病毒侵入何種受體細(xì)胞起到絕對性的作用。根據(jù)VP1基因的差異可以將EV71分為A,B和C三個基因型，并且還可以再細(xì)分為B1-B5、C1-C5亞型。本實驗室分離到的EV71病毒株2011JDZ35和2011JDZ202均屬于C4a亞型，與國內(nèi)近幾年來主要流行株亞型一致。

從對VP1氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，2011JDZ202株在297個氨基酸位點的比對中發(fā)現(xiàn)有3個位點發(fā)生了明顯變異，分別是在第19位，38位，和293位；而2011JDZ35株有2個位點發(fā)生明顯變異，分別是在第19位和106位。以上位點的突變具有一定的規(guī)律性，相對保守。VP1區(qū)位于病毒衣殼的最外面，其內(nèi)部的氨基酸改變能夠引起外膜蛋白的結(jié)構(gòu)變化，使其可能能夠突破血腦屏障，出現(xiàn)腦炎癥狀。猜測上述突變位點對病毒的臨床表現(xiàn)提供了相應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)。

[1]金奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:606-613.

[2]黃建國,吳立文,駱志輝,等.手足口病腸道病毒 EV71和CoxA16感染的檢測分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學(xué),2011,29(3):328-329.

[3]涂智杰,胡芹,曹金萍.腸道病毒71型景德鎮(zhèn)分離株全基因組序列分析[J].軍事醫(yī)學(xué),2013;37(1):69-72.

[4]Zhang Y,Zhu Z,Yang W.An emerging recombinant human enterovirus 71 responsible for the 2008 outbreak of hand foot and mouth disease in Fuyang city of China[J].Virol J,2010,7:94.

[5]王璟,許國章,顧文珍.腸道病毒71型寧波分離株全基因組特征研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志 2012;22(2):270-272.

[6]檀曉娟,許文波.腸道病毒71型的分子流行病學(xué)現(xiàn)況[J].中國疫苗和免疫,2008,14(4):361-367.