謝龍金 ，張長(zhǎng)林 ，欒素清 ，聞芳 ，江梅 ，萬(wàn)臘根

(1、南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院輸血科，江西 南昌330003；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

急性早幼粒細(xì)胞白血病 (acute promyelocytic leukemia，APL)是一種以早幼粒細(xì)胞分化受阻為主要特征的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。研究表明，90%以上的APL患者的白血病細(xì)胞中均存在非隨機(jī)染色體易位t(15;17)(q22;q21)，該易位使得17號(hào)染色體上的維甲酸受體(retinoic acid receptor，RARα)基因與位于15號(hào)染色體上的PML(promylocytic leukemia)基因發(fā)生融合，形成PML-RARα融合基因，并編碼相應(yīng)的融合蛋白。PML-RARα融合蛋白能以“顯性負(fù)(dominant negative)”的方式抑制野生型PML和RARα的正常功能，導(dǎo)致骨髓粒細(xì)胞的分化受阻，是導(dǎo)致APL發(fā)病的關(guān)鍵分子[1,2]。

研究發(fā)現(xiàn)，有23%~43%APL患者除了含有t(15;17)易位,還伴隨著其它染色體異常。常見(jiàn)的異常有+8、+21、7q-、9q-、以及 ider(17)(q10)等[3]。 ider(17)(q10)是由t(15;17)易位衍生的17號(hào)染色體長(zhǎng)臂等臂形成的衍生染色體，從而導(dǎo)致細(xì)胞中存在兩個(gè)PML-RARα融合基因，而17號(hào)染色體短臂缺失[4]，有學(xué)者認(rèn)為ider(17)(q10)t(15;17)可能是APL預(yù)后不良的因素[5-8]，但是在國(guó)內(nèi)有關(guān)ider(17)(q10)異常的APL的臨床和實(shí)驗(yàn)特征很少報(bào)道。我們報(bào)道1例初診的含ider(17)(q10)異常的APL患者，并結(jié)合文獻(xiàn)分析此類(lèi)少見(jiàn)變異易位的實(shí)驗(yàn)室和臨床特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 患者，女，62歲，患者于2011年4月17日因“無(wú)誘因牙齦、鼻腔出血”入院。中度貧血貌，牙齦出血，全身皮膚可見(jiàn)陳舊性瘀點(diǎn)，淺表淋巴結(jié)無(wú)腫大。胸骨無(wú)壓痛，心肺聽(tīng)診正常，肝脾肋下未觸及，眼底鏡檢查示視網(wǎng)膜出血。血常規(guī)示：白細(xì)胞 0.7×109/L，血紅蛋白 60g/L，血小板 31×109/L。 門(mén)診以全血細(xì)胞減少癥收入住院。經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫分型檢查確診為急性早幼粒細(xì)胞白血病，遂予全反式維甲酸 (all-trans-retinoic acid，ATRA)聯(lián)合亞砷酸、三氧化二砷治療，患者完全緩解出院。

1.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 骨髓細(xì)胞涂片經(jīng)常規(guī)瑞氏染色后，油鏡下分類(lèi)計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，計(jì)算各系各階段細(xì)胞所占比例，并觀察其形態(tài)；全片計(jì)數(shù)巨核細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)。

1.3 傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)分析 取骨髓液2ml，肝素抗凝，有核細(xì)胞計(jì)數(shù)后按(1~2)×106/ml進(jìn)行直接法和短期培養(yǎng)法制備染色體并采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。染色體核型描述按《人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN 2005)》。

1.4 熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測(cè)PML-RARα融合基因LSI PMLRARα雙色雙融合探針購(gòu)自美國(guó)Vysis公司。探針應(yīng)用SpectrumOrangeTM標(biāo)記PML基因、Spectrum-GreenTM標(biāo)記RARα基因。FISH操作步驟包括：滴片、變性、雜交、洗滌、復(fù)染以及熒光顯微鏡觀察間期細(xì)胞和分裂期細(xì)胞雜交信號(hào)。正常細(xì)胞信號(hào)為：兩紅兩綠無(wú)融合信號(hào)(2O2G0F)；發(fā)生典型易位表現(xiàn)為：一紅一綠兩融合信號(hào)(1O1G2F)，閾值為0.2%。計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，判斷結(jié)果。

1.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PML-RARα融合基因 取患者骨髓0.5ml加入1ml RNA提取試劑Trizol，然后按照invitrogen公司的說(shuō)明書(shū)提取RNA。將獲得的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR上下游引物分別為：正向引物：5'-ccgtcataggaagtgaggtct-3'，反向引物：5'-ggctgggcactatctcttca-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)122bp。

2 結(jié)果

2.1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 有核細(xì)胞增生極度活躍，粒系增生極度活躍，以顆粒增多的異常早幼粒細(xì)胞為主，占83.5%；早幼粒細(xì)胞大小不一，胞漿量豐富，呈淡藍(lán)色，胞漿中有粗大、紫紅色顆粒，可見(jiàn)大量Auer小體，胞核大、不規(guī)則、有折疊、凹陷，核染色質(zhì)細(xì)致，核仁l~3個(gè)，清晰可見(jiàn)。淋系、紅系及巨核系增生受抑，血小板散在少見(jiàn)，見(jiàn)圖1。

圖1 患者骨髓細(xì)胞染色

2.2 常規(guī)G顯帶細(xì)胞遺傳學(xué) 顯微鏡下分析20個(gè)中期分裂相結(jié)果提示：46,XX,der(15)t(15;17)(q22;q21),ider(17)(q10)t(15;17)(q22;q21)/46,XX,t(15;17)(q22;q21)/46,XX(圖 2)。

圖2 G-顯帶顯示患者骨髓細(xì)胞核型

2.3 FISH結(jié)果 計(jì)數(shù)500個(gè)間期細(xì)胞示：45%(225/500)的細(xì)胞為正常信號(hào)模式：即2O2G0F模式。39%(195/500)的細(xì)胞為典型的t(15;17)易位模式：即 1O1G2F，還有 16%(80/500)細(xì)胞呈現(xiàn) 1O1G3F信號(hào)模式。另外，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)分裂中期細(xì)胞示三個(gè)融合信號(hào)，其中的兩個(gè)融合信號(hào)在一條染色體上，并以著絲粒對(duì)稱 (圖3)。

2.4 RT-PCR結(jié)果 取患者骨髓細(xì)胞，通過(guò)RTPCR檢測(cè)PML-RARα基因的表達(dá)，結(jié)果如圖4示，患者表達(dá)PML-RARα融合基因，由于PCR引物是針對(duì)L型PML-RARα設(shè)計(jì)的、表明患者細(xì)胞中PML-RAR為L(zhǎng)型。

圖3 雙色雙融熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)PML-RARα融合基因

圖4 RT-PCR檢測(cè)患者骨髓細(xì)胞PML-RARα融合基因

3 討論

根據(jù)2008年WHO血液腫瘤分型要求，將含有t(15;17)或PML-RARα融合基因的急性白血病歸為APL，即使是患者骨髓或外周血異常早有粒細(xì)胞低于20%[9]，因此，檢測(cè)白血病患者有無(wú)染色體t(15;17)易位或PML-RARα融合基因是APL診斷的重要手段。在目前常用于檢測(cè)染色體t(15;17)或PML-RARα融合基因的方法有常規(guī)染色體顯帶技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)和RT-PCR方法[10,11]。染色體顯帶技術(shù)是對(duì)處于細(xì)胞分裂中期的染色體進(jìn)行分析的技術(shù)，該方法可以檢測(cè)任何染色體的異常，其缺點(diǎn)是對(duì)技術(shù)人員要求高，靈敏度低；FISH技術(shù)是根據(jù)核酸雜交的原理設(shè)計(jì)探針，與細(xì)胞中的DNA進(jìn)行雜交，達(dá)到檢測(cè)細(xì)胞中DNA的異常改變，這種方法特異性好，靈敏度高，可以檢測(cè)到微小的DNA變異，但只能針對(duì)已知的染色體異常進(jìn)行檢測(cè)；PCR的方法靈敏度高，但是容易產(chǎn)生污染。在臨床只采用某種單一檢測(cè)手段可能會(huì)造成漏診，需要多種方法聯(lián)合檢測(cè)。在本研究中，我們第一次通過(guò)常規(guī)G顯帶細(xì)胞遺傳學(xué)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)患者骨髓細(xì)胞的核型異常，而采用雙色雙融熒光原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)患者有39%的細(xì)胞出現(xiàn)典型的t(15;17)易位模式(1O1G2F)，同時(shí)還有16%的細(xì)胞為復(fù)雜的易位信號(hào)(1O1G3F)，并在一個(gè)分裂期細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一條染色體的融合信號(hào)以著絲粒對(duì)稱(圖3)，提示細(xì)胞中有t(15;17)易位，并且存在復(fù)雜的易位模式。在第二次行染色體分析時(shí)發(fā)現(xiàn)8個(gè)46,XX,t(15;17)(q22;q21)核型，兩個(gè)細(xì)胞為46,XX,der(15)t(15;17)(q22;q21),ider(17)(q10)t(15;17)(q22;q21)核型，這一結(jié)果與FISH結(jié)果相互印證。ider(17)(q10)t(15;17)是由t(15;17)衍生出來(lái)的 17號(hào)染色體長(zhǎng)臂等臂形成的衍生染色體，使得患者細(xì)胞中出現(xiàn)兩個(gè)PML-RARα融合基因，同時(shí)17號(hào)染色體短臂丟失。到目前，在全世界范圍內(nèi)報(bào)道過(guò)伴有這種染色體易位的病例有60多例，其中在我國(guó)大陸報(bào)道只有3例[12-14]。

基于對(duì)本病例的研究并結(jié)合文獻(xiàn)資料[4-8,13-15]，伴ider(17)(q10)異常的 APL具有以下臨床和實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)：(1)病例分散，世界上多個(gè)國(guó)家有報(bào)道。(2)男性患者多見(jiàn)，已有病例中男女比例為2.19/1，在華人中男女比例為4/1，在我國(guó)大陸為3/1。(3)大部分病例外周血白細(xì)胞減低，其中64.3%的病例WBC 在 0.7～3.1×109/L 之間 (均數(shù)為 1.5×109/L)，14.3%病例 WBC在 4.04～8.5×109/L之間 (均數(shù)為6.2×109/L)，21.4%病例 WBC 在 12.04～41.67×109/L之間(均數(shù)為22.4×109/L)。(4)骨髓形態(tài)上主要表現(xiàn)為顆粒增粗型白血病細(xì)胞，在骨髓形態(tài)學(xué)資料可用的病例中占95%。(5)在11例進(jìn)行了RT-PCR檢測(cè)的患者中，其中9例為長(zhǎng)型PML-RARα轉(zhuǎn)錄本(60%)，5 例為短型 PML-RARα 轉(zhuǎn)錄本 (33.3%)，1例為變異型PML-RARα轉(zhuǎn)錄本(6.7%)。(6)在已有的資料中，除兩例患者經(jīng)維甲酸治療無(wú)效外，其它病例經(jīng)維甲酸或砷劑治療后獲得緩解。

綜上所述，伴ider(17q)異常的APL為一種特殊的細(xì)胞遺傳學(xué)亞型，具有獨(dú)特的臨床和生物學(xué)特征。為了更好地闡明其性質(zhì)，需要積累更多的病例進(jìn)行系統(tǒng)的分析研究。

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