林媛媛 ，婁遠蕾 ，梁昌達 ，謝淑佩 ，謝安

(1、江西省兒童醫(yī)院血液科，江西 南昌330006；2、南昌大學泌尿外科研究所，江西 南昌330006)

上皮－間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種基本的生理病理現象，是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞發(fā)生轉化的現象，是一種哺乳動物胚胎發(fā)育與器官形成中的必需的生理過程[1]。由于EMT是上皮細胞獲得遷移能力的有效方法，越來越多的研究發(fā)現，大量上皮細胞惡性腫瘤的浸潤肌轉移與此有關，因此研究EMT的發(fā)生和調控機制，對于尋找治療惡性腫瘤特別是腫瘤轉移的目標靶點的研究具有重要意義。

誘導多能干細胞 (induced pluripotent stem cells，iPS細胞)是通過向體細胞中導入誘導基因，使體細胞重編程獲得具有胚胎干細胞 (ES細胞)樣特性的多能干細胞[2]。IPS細胞在細胞形態(tài)，生長特性，標志物，畸胎瘤形成等各類生物學特性均與胚胎干細胞類似[3]，同ES細胞一樣，iPS細胞可作為胚胎發(fā)育的一個模型，同時干細胞與腫瘤相似的增殖及分化特性，對人iPS細胞的EMT的研究，對于研究EMT在組織胚胎發(fā)育以及腫瘤發(fā)生轉移中調控機制，具有十分重要的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人iPS細胞系UMC-iPS由中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院惠贈[4]。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM/F12培養(yǎng)基、Knockout血清替代物、DMEM高糖培養(yǎng)基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、巰基乙醇、堿性成纖維生長因子b-FGF(Gibco公司)；胎牛血清(北京全式金生物技術有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；反轉錄試劑盒(TAKARA公司)；兔抗OCT-4(Abcam公司)；Tritc標記牛抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗 E-cadherin、兔抗N-cadherin、兔抗Slug及兔抗Snail(Cell Signaling Technology公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；牛血清白蛋白 BSA(Roche公司)；Ⅳ型膠原酶、DAPI、絲裂霉素C、RA和明膠(Sigma公司)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司。倒置相差熒光顯微鏡X71(Olympus公司)，PCR 儀(Biometra 公司)，Western blot電泳及轉印系統(tǒng)(Bio-Raid公司)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配置 人iPS細胞培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基、20% 的Knockout血清替代物(SR)、1%非必需氨基酸、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L β-巰基乙醇、8ng/ml b-FGF。擬胚體(embryoid body，EB)培養(yǎng)基：無b-FGF的iPS細胞培養(yǎng)基。小鼠成纖維細胞培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清。

1.3.2 人iPS細胞的傳代培養(yǎng) 將人的iPS細胞接種于絲裂霉素C處理過的小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上，iPS細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。待集落長滿飼養(yǎng)層，用1mg/ml的Ⅳ型膠原酶消化15~20min，將集落吹下，加入3~5ml培養(yǎng)液,輕輕吹散成小集落，均勻接種于飼養(yǎng)層細胞上。

1.3.3 人iPS細胞的分化 為方便收集及后續(xù)研究，我們將iPS細胞制備成擬胚體(EB)使其自然分化。操作如下：將消化下來的iPS細胞集落移至一培養(yǎng)皿中,差速貼壁30min,去除剩余的飼養(yǎng)層細胞,EB培養(yǎng)基吹打成小的細胞團,接種到低黏附的細菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隔天換液，分別于0d、7d、14d、21d、28d收集EB細胞檢測。

1.3.4 人iPS細胞的鑒定 免疫熒光染色：4%多聚甲醛固定15min，1%BSA 37℃ 封閉30min,加入OCT-4一抗 (1：100)，37 ℃孵育 2 h，PBS洗滌后加入熒光標記二抗 (1：200)，37℃孵育1 h，PBS洗滌后DAPI(1：100)染核5 min，洗滌晾干后甘油封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。AP染色：參考試劑盒說明書操作，細胞染藍紫色為陽性。

1.3.5 RT-PCR檢測 收集未分化(DO)及分化7d、14d、21d、28d(DO~D28)的 iPS 細胞，Trizol法提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書進行操作，用隨機引物逆轉錄合成cDNA后進行PCR擴增，PCR反應條件如下：94℃預變性 5min，94℃變性 30 s，60℃退火 30s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)，72℃延伸10min。GAPDH作為內參。各引物序列及產物長度如下：AFP (171bp)：F5' -AAAAGCCCACTCCAGCAT C-3'，R5'-ATAGCGAGCAGCCCAAAGA-3'；Flk-1(136 bp)：F 5'-AGTGGTATGGTT CTTGCCTCAG-3'，R 5'-AGCCGCTTGTCTGGTTTGA-3'；Pax6(239b p)：F5'-TTT CAGCACCAGTGTCTACCA-3'，R 5'-CATAACTCCGCCCATTCA-3'；E-cadherin(220bp)：F5'-GCTCTTCCAGGAACCTCTGTG-3'，R5'-CAGC TTGAACCACCAGGGTA-3'；N-cadherin(224 bp)：F 5'-GAGCTTG TCAGGATCAGGTCTG-3'，R5'-A ATGTCAATGGGGTTCTCCAC-3'；Slug(223 bp)：F5'-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3'，R5'-AAGAGGAG AGAGGCCATTGG-3'；Snail(259bp)：F 5'-CCAAT CGGAAGCCTAACTAC-3'，R5'-CCTTTCCCACT GTCCTCATC-3'；GAPDH(312 bp)：F5'-ATCCCAT CACCATCTTCC-3'，R5'-GAGTCCTTCCACGATA CCA-3'。擴增產物經含Goldviewnal型核酸染色液的1.5%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.6 蛋白印記技術(Western Blot)檢測 各組樣品取等量蛋白質30μg，經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。經5%脫脂奶粉于室溫封閉1h后，加入帶檢測抗體，室溫孵育2h；洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(1：2000)，室溫孵育1h，洗膜，用ECL化學發(fā)光試劑盒檢測雜交信號?；瘜W發(fā)光檢測系統(tǒng)取像并分析。

2 結果

2.1 人iPS細胞的生長狀態(tài)及未分化鑒定 iPS細胞呈典型的克隆狀生長?？寺〕蕡A形或橢圓形，生長旺盛，克隆邊界清晰，克隆內細胞排列緊密，高倍鏡下形似鳥巢。人iPS的集落與飼養(yǎng)層之間的邊界清楚，推開飼養(yǎng)層生長。一般每3~4d傳代。AP染色及OCT-4免疫熒光染色陽性，示人iPS細胞處于未分化狀態(tài)。見圖1。

2.2 人iPS細胞自然分化時基因表達變化 為判斷人iPS細胞是否自然分化，我們檢測了三陪層細胞的標記物AFP、FLK-1及Pax6，D0未見iPS細胞表達，提示細胞處于未分化狀態(tài)，D7~D28，三者具有表達，提示iPS細胞已發(fā)生分化。RT-PCR分析EMT相關基因發(fā)現，iPS細胞在未分化時(D0)E-cadherin轉錄因子表達明顯，并且在自然分化狀態(tài)仍持續(xù)表達(D7~D28)，而N-cadherin轉錄因子在iPS未分化狀態(tài)未見表達，細胞發(fā)生分化后，N-cadherin轉錄因子的表達迅速上調。Snail和Slug轉錄因子為E-cadherin蛋白抑制物，我們RT-PCR分析發(fā)現，iPS細胞在未分化時(D0)，Slug未見表達，Snail也僅見低水平表達，但細胞發(fā)生分化后(D7~D28)，Snail和Slug轉錄因子的表達均得到增強。見圖2。

圖1 iPS細胞生長及未分化鑒定

圖2 人iPS細胞自然分化時基因表達變化

2.3 人iPS細胞自然分化時EMT相關蛋白表達變化 通過對人iPS細胞總裂解產物的Western blot分析發(fā)現，細胞未分化時(D0)，總E-cadherin蛋白表達明顯，但細胞分化后(D7~D28)，E-cadherin蛋白表達量迅速下調，僅見微量表達；與此相反，細胞未分化時(D0)總N-cadherin蛋白未見表達，而細胞分化后其蛋白表達逐漸升高。與此同時，細胞未分化時Slug與Snail蛋白均未見表達，而細胞分化后(D7~D28)，Slug與Snail蛋白表達明顯上升。見圖3。

圖3 人iPS細胞自然分化時EMT相關蛋白表達變化

3 討論

EMT以上皮細胞極性的喪失及其間質特性的獲得為主要特征，與胚胎的形成、發(fā)育和腫瘤的侵襲轉移有關。研究表明，EMT發(fā)生過程中最重要的標志性變化是上皮細胞標志物E-cadherin的減少或丟失，間質細胞表型標記物N-cadherin等表達上調[5]。為檢測人iPS細胞在自然分化過程中是否發(fā)生EMT轉變，我們采用RT-PCR和Western blot檢測iPS細胞在自然分化前后相關基因和蛋白的改變。Western blot結果表明，未分化iPS細胞可見E-cadherin蛋白的表達，分化后E-cadherin的表達明顯減少，而N-cadherin在細胞未分化時未見表達，發(fā)生分化后表達明顯上調。表明iPS細胞自然分化時發(fā)生了由上皮細胞向間質細胞轉化的EMT。

Snail是一種含有鋅指結構的DNA結合蛋白，可以識別并與E-cadherin啟動子部位的E-box結合,抑制E-cadherin基因的表達[6]，迄今為止，所有EMT過程研究中，均發(fā)現Snail基因參與其中，細胞中Snail與E-cadherin的表達呈負相關[7]，缺乏E-cadherin的細胞出現大量的Snail，將Snail轉染至E-cadherin陽性的細胞將誘導EMT的發(fā)生，并表達出間質標記物[8]。Slug和Snail同屬于一個轉錄因子家族，主要作用與神經嵴細胞的發(fā)育以及幾種中胚層來源的器官如肺、后腎等的形成有關，主要表達在上皮細胞和未分化的間質細胞中，維持未分化表型[9]。與Snail一樣，Slug也可以下調E-cadherin的表達。本研究中發(fā)現，在人iPS細胞分化過程中，Snail和Slug轉錄因子以及蛋白都明顯發(fā)生上調，顯示iPS細胞分化后E-cadherin的表達下調可能與Snail和Slug的調節(jié)有關。

iPS細胞具有ES細胞的發(fā)育多潛能性，并且回避了ES細胞長期以來的倫理爭議，因此除細胞替代等臨床應用研究外，在胚胎發(fā)育、組織功能等基礎研究方面也具有獨特的優(yōu)勢并越來越受到重視[10]。此外，iPS細胞在癌癥研究中也能發(fā)揮巨大的作用，從某些方面來看，iPS細胞與腫瘤細胞具有很多相似之處，比如，它們都具有永生化特點，并能致瘤，抗癌基因p53失活能夠使重編程速度得到極大提升等[11,12]。目前甚至有研究發(fā)現，用iPS細胞培育出癌癥干細胞[13]。因此利用iPS細胞作為模型，探索其分化時EMT的轉變過程，對于研究組織胚胎發(fā)育以及腫瘤細胞發(fā)生轉移過程中EMT的變化及分子機制，具有十分重要的作用。

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