陳 楓，楊愛萍，李 燕，史小玲，唐小平，唐 莉，王曉燕，陳 莊△

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州 730030）

糖尿病是以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病群。中國糖尿病和糖尿病前期患病率分別高達(dá)9.7%和15.5%［1］。持續(xù)性高血糖對(duì)許多臟器如腎臟、心腦血管纖維化具有明顯促進(jìn)作用，與肝臟纖維化的關(guān)系也在研究之中［2－3］。但其機(jī)制未能完全闡明。肝細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）分解代謝平衡主要是由TIMPs／MMPs系統(tǒng)調(diào)控，其中金屬蛋白酶組 織 抑 制 劑－1 （tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMP－1）／金 屬 基 質(zhì) 蛋 白 酶－1 （matrix metalloproteinase－1，MMP－1）的變化更能準(zhǔn)確反映肝臟中ECM的合成和降解情況［4］。為了更好地分析高血糖對(duì)肝纖維化的影響，TIMP－1／MMP－1系統(tǒng)在糖尿病相關(guān)性肝纖維化中的作用，現(xiàn)將糖尿病對(duì)大鼠肝纖維化組織TIMP－1／MMP－1表達(dá)的影響報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 鏈尿佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司）；檸檬酸、檸檬酸三鈉（上海前塵生物公司）；四氯化碳（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）；透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（laminin，LN）、Ⅳ型膠原蛋白（collagen typeⅣ，C－Ⅳ）和Ⅲ型前膠原（procollagen typeⅢ，PⅢNP）試劑（鄭州安圖生物公司）；總RNA試劑盒（北京天根生化公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0，SYBR Premix Ex TaqⅡ（大連寶生物公司）；MMP－1、TIMP－1、β－actin RT－PCR擴(kuò)增引物（上海生工合成，引物序列見表1）；微量血糖測定儀，血糖試紙（美國強(qiáng)生公司）。pH4.5的檸檬酸緩沖液配制：A液0.1mol／L的檸檬酸；B液0.1mol／L的檸檬酸三鈉，A∶B＝1∶1.32（用前配制）；1%STZ溶液配制：稱所需質(zhì)量的STZ，溶于其相應(yīng)體積的pH4.5的檸檬酸緩沖液中（腹腔注射前溶解）。

表1 RT－PCR基因及引物序列

1.2 動(dòng)物模型 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量300～350 g，共40只，購于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組、肝纖維化組、糖尿病肝纖維化組（雙模型組），各10只。實(shí)驗(yàn)前大鼠尾尖采血，測定血糖值，正常大鼠方可用于試驗(yàn)。正常對(duì)照組：腹腔注射同體積的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液和花生油溶液。糖尿病組：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾尖采血，測定血糖大于16.7mmol／L為糖尿病模型大鼠［5］。肝纖維化組：皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次劑量0.4mL／kg，以后每隔3天注射0.2mL／kg。雙模型組：一次性腹腔注射STZ 35mg／kg，48h尾靜脈采血，測定血糖，7d后重復(fù)測定血糖，血糖大于16.7mmol／L的大鼠皮下注射40%的四氯化碳花生油溶液，首次劑量0.4mL／kg，以后每隔3天皮下注射0.2mL／kg，8周末腹腔注射1%戊巴比妥麻醉，處死各組大鼠。心臟取血、剖腹取肝組織。

1.3 指標(biāo)檢測 全自動(dòng)生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alaniine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotran－sferase，AST）、血漿清蛋白（albumin，ALB）和清蛋白／球蛋白（A／G）。化學(xué)發(fā)光法測定 HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ。RT－PCR（SYBR Green相對(duì)定量法）檢測肝臟組織α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）、MMP－1和TIMP－1表達(dá)。取肝臟組織50mg磨碎，提取總RNA，制備cDNA模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：MgCl22μL、10RT Buffer 1μL、dNTP Mixture 1μL、RNase Inhibittor 0.25μL、AMV Reverse Transriptase 0.5μL、Oligo dT－Adaptor Primer 0.5μL、RNase Free d H2O 3.75μL、樣品RNA 1μL、Total volume 5μL。30℃10min，42℃30min，99℃5min，5℃5min。

RT－PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、dH2O 8.5μL、樣品RNA 2μL、Total volume 25μL。95℃30s，95℃5s，59.5℃10s，檢測實(shí)時(shí)熒光，共40個(gè)循環(huán)；65～95℃生成融解曲線，每個(gè)步驟10s，＋0.5℃／循環(huán)并行實(shí)時(shí)熒光檢測，共60個(gè)循環(huán)。

病理檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束以后，將大鼠處死，剖腹取肝臟，固定，脫水，石蠟包埋，VG染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示。對(duì)樣本數(shù)先行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)用One－Way ANOVA檢驗(yàn)。方差不齊時(shí)用Kruskal－Wallis H檢驗(yàn)比較總的差異，再用Mann－Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肝功能指標(biāo) 與正常對(duì)照組比較，肝纖維化組和雙模型組ALT、AST濃度明顯升高，ALB、A／G明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組ALT、AST濃度明顯升高和ALB、A／G明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組ALT、AST升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 大鼠血清肝纖維化指標(biāo) 與正常對(duì)照組比較，肝纖維化組、雙模型組HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ 明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組HA、LN、PⅢNP、C－Ⅳ 明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組HA、C－Ⅳ升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3 肝組織VG染色變化 正常對(duì)照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索排列規(guī)則有序，未見脂肪變性、壞死，無膠原纖維增生；糖尿病組肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，少量出現(xiàn)炎性壞死、脂肪變性；肝纖維化組肝細(xì)胞廣泛脂肪變性、壞死，炎性細(xì)胞浸潤，以匯管區(qū)及中央靜脈周圍較重。有纖維組織增生的情況，但未形成假小葉；雙模型組中大部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞索排列失去放射狀結(jié)構(gòu)，纖維結(jié)締組織增生形成寬窄不一的纖維條索，伸入肝實(shí)質(zhì)中，形成纖維間隔，包繞、分割正常肝組織，形成假小葉。見圖1和表4。

表2 4組大鼠肝功能指標(biāo)比較

表2 4組大鼠肝功能指標(biāo)比較

a：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n ALT（U／L） AST（U／L） ALB（g／L） A／G正常對(duì)照組 10 68.460±17.534 106.928±19.659 42.582±7.667 1.235±0.420糖尿病組 10 85.723±18.998 112.615±20.178 42.446±7.915 1.228±0.143肝纖維化組 10 171.532±17.415ab 175.518±23.711ab 32.046±9.982ab 0.711±0.312ab雙模型組 10 224.914±23.321abc 234.058±18.001abc 31.762±7.768ab 0.703±0.408ab

表3 4組大鼠肝纖維化指標(biāo)濃度的比較（ng／mL

表3 4組大鼠肝纖維化指標(biāo)濃度的比較（ng／mL

a：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n HA C－Ⅳ PⅢNP LN正常對(duì)照組 10 88.856±11.848 8.206±0.953 8.717±4.546 6.026±2.331糖尿病組 10 97.808±19.123 10.991±3.315 8.720±2.582 7.085±2.404肝纖維化組 10 194.892±14.594ab 16.223±3.217ab 15.122±5.335ab 10.561±1.319ab雙模型組 10 251.484±63.466abc 20.184±5.032abc 15.646±2.992ab 10.811±4.026ab

圖1 4組大鼠肝組織膠原纖維影像表現(xiàn)（VG染色，×100）

表4 4組大鼠纖維化分期和計(jì)分的比較）

表4 4組大鼠纖維化分期和計(jì)分的比較）

a：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n 分期（n）0 1 2 3 4 計(jì)分（分）正常對(duì)照組 10 10 0 0 0 0 0糖尿病組 10 10 0 0 0 0 0肝纖維化組 10 0 0 4 4 2 8.7±5.420雙模型組 10 0 0 2 4 4 13.6±6.813a

2.4 肝臟組織α－SMA、MMP－1和TIMP－1基因表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，肝纖維化組和雙模型組α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表 達(dá) 升 高，差 異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （P＜0.05）；與糖尿病組比較，肝纖維化組和雙模型組α－SMA、TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組α－SMA和TIMP－1及TIMP－1／MMP－1基因表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正 常 對(duì) 照 組 和 糖 尿 病 組 中 α－SMA、TIMP－1 及TIMP－1／MMP－1基因表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各組間MMP－1基因表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 4組大鼠肝臟組織中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表達(dá)水平的比較

表5 4組大鼠肝臟組織中的α－SMA、TIMP－1和MMP－1基因表達(dá)水平的比較

a：P＜0.05，與正常對(duì)照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較；c：P＜0.05，與肝纖維化組比較。

組別 n α－SMA TIMP－1 MMP－1 TIMP－1／MMP－1正常對(duì)照組 10 1.412±0.237 1.103±0.777 1.064±0.681 0.973±0.772糖尿病組 10 1.992±0.166 1.134±0.306 1.134±0.122 1.000±0.091肝纖維化組 10 3.285±0.054ab 3.816±0.887ab 1.488±0.421 2.561±0.307ab雙模型組 10 17.927±0.672abc 6.920±0.588abc 1.619±0.524 4.279±1.414abc

3 討 論

糖尿病與肝纖維化有密切關(guān)系，可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展，增加肝硬化和肝癌的發(fā)生［6－8］。同時(shí)，慢性肝損傷也可以影響糖代謝，形成惡性循環(huán)，但其機(jī)制未能闡明。高血糖作為糖尿病的重要表現(xiàn)，是各型糖尿病的共同特征。本研究采用鏈尿佐菌素誘導(dǎo)建立糖尿病模型，通過破壞胰島β細(xì)胞，誘發(fā)大鼠形成糖尿病。四氯化碳是常用的中毒性肝纖維化誘導(dǎo)物，通過細(xì)胞色素氧化酶代謝為三氯甲基自由基從而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死、凋亡［9］，反復(fù)刺激形成了炎癥細(xì)胞集聚、釋放細(xì)胞因子觸發(fā)間質(zhì)組織的過量膠原纖維產(chǎn)生肝纖維化。當(dāng)肝纖維發(fā)生時(shí)，細(xì)胞中ALT、AST釋放于血清是肝細(xì)胞炎癥和壞死的血清學(xué)指標(biāo)；ALB、A／G是肝細(xì)胞合成代謝功能的指標(biāo)，其降低程度與肝臟合成功能損害程度呈正比。ECM主要由膠原蛋白、LN、HA等成分組成，所以，ECM及其代謝產(chǎn)物是研究血清標(biāo)志物的首選。目前，HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ為常見的臨床檢測肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)，同時(shí)酶促化學(xué)發(fā)光法檢測具有密度好、準(zhǔn)確性高、溶血對(duì)檢測干擾少等優(yōu)點(diǎn)［10－11］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病組與正常對(duì)照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)沒有顯著區(qū)別，表明早期糖尿病對(duì)肝臟功能影響較小。肝纖維化組中，ALT、AST、HA、LN、PⅢNP和C－Ⅳ濃度高于正常對(duì)照組和糖尿病組，ALB、A／G明顯降低（P＜0.05），加之病理改變，證實(shí)造模成功。雙模型組與肝纖維化組比較，ALT、AST、HA和C－Ⅳ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），雙模型組是肝纖維化模型加糖尿病模型，說明糖尿病加重了肝臟纖維化程度，促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)展。其結(jié)果也與組織切片VG染色結(jié)果相符合，在大鼠纖維化分期和計(jì)分的比較中，雙模型組與肝纖維化組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

肝纖維化是各種慢性肝病的病理特征，其發(fā)生機(jī)制是ECM過度增生和異常沉積。研究表明，肝纖維化發(fā)生中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活和增殖。當(dāng)各種因素引起HSC激活后，HSC轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞并特異性表達(dá)α－SMA，主要表達(dá)于HSC胞核，說明α－SMA是HSC激活標(biāo)志，進(jìn)而成為提示肝纖維化病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)［12］。通過RT－PCR結(jié)果觀察到，與正常對(duì)照組和糖尿病組比較，肝纖維化組、雙模型組α－SMA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與肝纖維化組比較，雙模型組α－SMA的表達(dá)升高（P＜0.05）。這與方瑜潔等［13］的研究結(jié)果一致，提示高血糖可以促進(jìn)肝臟HSC活化、增殖，從而加重大鼠肝纖維化的程度。因此，HSC激活在糖尿病相關(guān)性肝纖維化的形成過程中可能起著重要的促進(jìn)作用。Sugimoto等［14］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高血糖可以引起HSC增生和Ⅰ型膠原的產(chǎn)生，提示高血糖是促進(jìn)肝纖維化發(fā)展的重要因素。其他體外實(shí)驗(yàn)也觀察到，不同高濃度的葡萄糖均能刺激HSC并導(dǎo)致HSC增殖，且DNA合成呈劑量依賴性［15］。所以，糖尿病持續(xù)性高血糖對(duì)肝纖維化的影響可能是通過激活HSC和增加膠原ECM的產(chǎn)生，進(jìn)而加重肝纖維化。

肝纖維化的產(chǎn)生是由于MMPs活性下降和（或）TIMPs活性升高導(dǎo)致ECM的合成和降解的失衡，從而出現(xiàn)ECM在肝內(nèi)過度沉積。MMPs是一組鋅離子依賴酶，它對(duì)于ECM中細(xì)胞外大分子如膠原具有降解作用，因此，是調(diào)節(jié)ECM動(dòng)態(tài)平衡最重要的一大酶系［16］；TIMPs是一組有抑制MMPs功能的活性多肽，與等比例的MMPs以共價(jià)鍵可逆結(jié)和形成復(fù)合體，從而抑制MMPs的活性。所以，TIMPs／MMPs系統(tǒng)在維持肝臟中ECM平衡起著重要作用。MMP－1是MMPs家族的一員，主要降解ECM中的Ⅰ、Ⅲ型膠原［17］，MMP－1的活性主要受特異性抑制物TIMP－1的調(diào)節(jié)。有研究表明，在肝纖維化發(fā)展過程中，TIMP－1的表達(dá)增強(qiáng)，TIMP－1／MMP－1的比值升高，使ECM降解減少，增加了膠原纖維的積累并促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展，是肝纖維化形成的重要因素［18］。因此，TIMP－1／MMP－1比值的改變更能準(zhǔn)確地反映肝臟中ECM合成和降解的情況［4］。本研究結(jié)果表明，與正常對(duì)照組和糖尿病組相比，肝纖維化組中TIMP－1表達(dá)增加、MMP－1變化不明顯，從而引起的TIMP－1／MMP－1改變導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，與文獻(xiàn)［19］一致。與肝纖維化組比較，雙模型組 TIMP－1、TIMP－1／MMP－1表達(dá)升高（P＜0.05），由此說明高血糖狀態(tài)下大鼠肝纖維化程度加重與TIMP－1表達(dá)增加相關(guān)，而不是 MMP－1表達(dá)減少，所以，TIMP－1／MMP－1失衡加劇了ECM的形成。糖尿病持續(xù)性高血糖影響TIMP－1／MMP－1系統(tǒng)的平衡，其可能的機(jī)制：高血糖激活了HSC的表達(dá)，激活的HSC釋放大量的TIMP－1，從而導(dǎo)致了TIMP－1／MMP－1失衡。其可能的機(jī)制還有高血糖狀態(tài)可能分泌大量 TNF－α、IL－1等炎癥介質(zhì)［20］，它們可以進(jìn)一步刺激 HSC 增 殖，影 響 TIMP－1／MMP－1的 平 衡。Wakisaka等［21］研究認(rèn)為，在高血糖情況下，ECM成分的改變會(huì)影響MMPs的表達(dá)。正常情況下，ECM中的正常成分通常作為ECM分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)信號(hào)。在血糖高的情況下，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，影響了TIMP－1／MMP－1正常表達(dá)和形成ECM的沉積。

因此，糖尿病加重肝纖維化發(fā)生的機(jī)制與TIMP－1／MMP－1的失衡有密切關(guān)系。深入研究糖尿病肝纖維化過程中HSC激活和TIMP－1／MMP－1調(diào)節(jié)性失衡異常的機(jī)制，可以更好地闡明糖尿病相關(guān)性肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，為臨床上防治糖尿病相關(guān)性肝纖維提供新的思路和治療方法。

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