孔 敏，周 芳，黨秀靜，武靜茹

（徐州醫(yī)學(xué)院／江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221002）

瘙癢是危害人類健康、影響人類生活質(zhì)量最常見的臨床病癥之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，普通人群瘙癢的發(fā)病率為8%～12%［1］，臨床上瘙癢癥狀可見于許多疾病及一些藥物的不良反應(yīng)［2－4］，其雖不致死卻給患者生存和生活帶來(lái)諸多不便［5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）家族參與瘙癢過程，比如TLR7介導(dǎo)了氯喹引起的急性瘙癢行為［6］，TLR2參與了溢脂性皮炎的發(fā)病過程［7］。TLR7與TLR家族中另一個(gè)成員TLR4在脊髓均有豐富的表達(dá)且分享諸多下游信號(hào)通路［8－9］，而后者在瘙癢過程中的作用，尤其是慢性瘙癢過程中的作用尚有待研究。因此，本研究擬探討脊髓TLR4在噁唑酮引起的慢性瘙癢中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇雄性昆明小鼠152只，體質(zhì)量18～20g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。于24℃下和晝夜交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境7d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究獲得徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 噁唑酮購(gòu)自Sigma公司，用丙酮溶解至0.5%；表 沒 食 子 兒 茶 素 沒 食 子 酸 酯 （epigaloctechin－3－gallt，EGCG）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；TLR4和β－肌動(dòng)蛋白（β－actin）一抗購(gòu)自Abcom公司，對(duì)應(yīng)二抗和Western blot顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

1.3 模型制作 按照文獻(xiàn)［10］的方法，實(shí)驗(yàn)前1d，瘙癢部位脫毛。在動(dòng)物頸背部脫毛處一次性涂抹噁唑酮（10μL，0.5%，溶于丙酮），7d后（時(shí)間重新從零計(jì)數(shù)，因此，首次刺激當(dāng)天記作－7d）開始激發(fā)，在第0、2、4、7、9、11天給予同等劑量噁唑酮進(jìn)行激發(fā)，觀察行為學(xué)和分子生物學(xué)改變。

1.4 行為學(xué)觀察 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在激發(fā)前均放入15cm×15 cm×15cm的透明玻璃盒子中適應(yīng)1h，涂抹溶媒或噁唑酮后重新放入盒子觀察其搔抓行為。動(dòng)物從后爪抬起到接觸頸背部皮膚，不管其在瘙癢部位搔抓多長(zhǎng)時(shí)間均記為一次完整的搔抓動(dòng)作，最后以30min內(nèi)完成的搔抓次數(shù)來(lái)衡量搔抓行為。

1.5 分組及處理 研究噁唑酮制慢性瘙癢模型，將小鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（C組）40只，只在頸背部脫毛，不做任何處理；丙酮溶媒組（A組）40只，頸背部脫毛處涂抹10μL丙酮；噁唑酮組（O組）40只，頸背部脫毛處涂抹10μL噁唑酮。每組再分為－7、0、4、9、11d5個(gè)亞組（n＝8），按模型制作方法涂抹相應(yīng)試劑，并在觀察激發(fā)后30min內(nèi)的行為學(xué)改變之后立即處死小鼠取脊髓頸膨大檢測(cè)TLR4。在確定噁唑酮致慢性瘙癢后9d小鼠脊髓TLR4表達(dá)水平接近高峰的基礎(chǔ)上，為研究腹腔注射EGCG的作用，將小鼠隨機(jī)分為丙酮溶媒組（A組）、丙酮溶媒＋EGCG組（A＋E組）、噁唑酮組（O組）和噁唑酮＋EGCG組（O＋E組），n＝8。各組在第9天激發(fā)后8h開始腹腔注射EGCG（40mg／kg）或生理鹽水，每8小時(shí)1次，直到第11天激發(fā)前，共計(jì)6次，最后一次給藥30min后激發(fā)，觀察激發(fā)后30min內(nèi)的行為學(xué)改變，之后立即處死小鼠取脊髓頸膨大檢測(cè)TLR4。

1.6 Western blot檢測(cè) －7d組在首次刺激后30min、其余各組在激發(fā)30min后隨機(jī)取6只小鼠，斷頭處死，快速取出脊髓組織，勻漿后，4℃下10 000×g離心30min，收集上清液，采用BCA（bicinchonininc acid）法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品于－80℃保存。蛋白樣本按1∶4加入5×SDS－PAGE上樣緩沖液，95℃變性5min，每孔加樣30μg用10%SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。加入1∶500稀釋的抗TLR4或β－actin一抗4℃過夜，TBST緩沖液，10×（Tris Buffered Saline Tween－20，10×）洗膜后，加入1∶1 000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（購(gòu)自中國(guó)南京碧云天生物科技有限公司）室溫孵育1h，NBT／BCIP試劑盒（購(gòu)自中國(guó)南京碧云天生物科技有限公司）顯色。掃描條帶，采用Adobe Photoshop軟件分析各組灰度值，并以激發(fā)前TLR4表達(dá)為整體進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后反映TLR4的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與首次激發(fā)前相比，激發(fā)后各時(shí)間點(diǎn)小鼠的脊髓TLR4表達(dá)逐漸增加（圖1），且與搔抓行為呈正相關(guān)關(guān)系（r＝0.947）。3組小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)30min內(nèi)的搔抓次數(shù)見表1。

在EGCG腹腔注射實(shí)驗(yàn)中（圖2～3），與噁唑酮組相比，O＋E組小鼠搔抓次數(shù)明顯減少（P＜0.05）、脊髓TLR4表達(dá)明顯降低（P＜0.05），但仍高于丙酮溶媒組和 A＋E組（P＜0.05）。丙酮溶媒組和A＋E組的搔抓次數(shù)及TLR4表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 首次刺激及激發(fā)后各時(shí)間點(diǎn)脊髓TLR4表達(dá)

圖2 4組小鼠搔抓次數(shù)比較

圖3 4組小鼠脊髓頸膨大TLR4表達(dá)水平比較

表1 3組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)30min內(nèi)搔抓次數(shù)比較（，次）

表1 3組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)30min內(nèi)搔抓次數(shù)比較（，次）

＊：P＜0.05，與噁唑酮組比較。

組別 n －7d 0d 4d 9d 11d對(duì)照組 40 2.03±0.27 2.13±0.35＊ 2.00±0.93＊ 2.00±0.76＊ 2.38±0.74＊丙酮溶媒組 40 2.21±0.37 2.22±0.31＊ 3.62±0.74＊ 6.75±1.98＊ 7.25±1.83＊噁唑酮組 40 2.13±0.26 26.37±5.32 76.25±15.11 139.25±15.53 173.00±13.84

3 討 論

2009～2010年是脊髓水平瘙癢發(fā)病機(jī)制研究突飛猛進(jìn)的2年，有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角表達(dá)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體－2（glutamine transporter type 2，VGLUT－2）的神經(jīng)元參與組胺依賴性和非組胺 依 賴 性 瘙 癢 的 介 導(dǎo)［11－12］；GRP／GRPR（gastin－releasing peptide，GRP；gastin－releasing peptide reportor，GRPR）介導(dǎo)了從外周到脊髓的瘙癢信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且認(rèn)為GRPR可以作為瘙癢的脊髓標(biāo)志物［13－14］，這些都提示，脊髓水平在瘙癢的發(fā)生過程中起著重要的作用。

最近研究發(fā)現(xiàn)，TLR7介導(dǎo)了氯喹引起的急性瘙癢［6］。TLR家族成員分享諸多下游信號(hào)通路，如MyD88作為TLR7和TLR4的共同下游分子參與了諸多病理、生理過程［8－9］。但TLR4是否也參與瘙癢過程尚有待研究。慢性瘙癢較急性瘙癢持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、危害更大，因此，研究慢性瘙癢的發(fā)病機(jī)制顯得更為重要和現(xiàn)實(shí)。小鼠頸背部皮膚局部反復(fù)涂抹噁唑酮可以誘發(fā)慢性皮炎、引起搔抓行為，成功復(fù)制慢性瘙癢模型，在每次涂抹噁唑酮后能產(chǎn)生在1h內(nèi)較為嚴(yán)重的搔抓行為，此后溫和的搔抓可持續(xù)至少8h，并且模型較穩(wěn)定［10，15］。因此，本研究采用上述模型，選取代表性時(shí)間點(diǎn)（－7d，激發(fā)后0、4、9、11 d），研究脊髓TLR4水平在慢性瘙癢過程中的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)物搔抓行為與脊髓TLR4表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r＝0.947。TLR7通過進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路參與急性瘙癢過程，但是在噁唑酮引起的瘙癢過程中TLR4是否也同樣是通過這些下游通路發(fā)揮作用尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

EGCG是綠茶中的一種黃酮類物質(zhì)，作為TLR4的抑制劑已經(jīng)成熟應(yīng)用于TLR4相關(guān)的病理、生理過程的研究［16］。離體和體實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，EGCG可能是通過抑制TLR4激活，進(jìn)而抑制TLR4下游信號(hào)的傳遞發(fā)揮藥理作用［17］。為進(jìn)一步驗(yàn)證脊髓TLR4參與了噁唑酮引起的慢性瘙癢過程，本研究從噁唑酮激發(fā)后第9天開始每8小時(shí)腹腔注射EGCG 1次，每次劑量（40mg／kg），直到第11天激發(fā)前，共計(jì)6次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多次注射EGCG可以部分抑制而不能完全抑制噁唑酮引起的搔抓行為，說(shuō)明還有其他機(jī)制參與噁唑酮引起的慢性瘙癢過程。

綜上所述，本研究成功復(fù)制了局部皮膚涂抹噁唑酮致慢性瘙癢模型，且發(fā)現(xiàn)脊髓TLR4表達(dá)水平與瘙癢行為相關(guān)，腹腔注射EGCG能抑制瘙癢行為和脊髓TLR4表達(dá)。脊髓TLR4參與了噁唑酮引起的慢性瘙癢過程，豐富了慢性瘙癢的發(fā)生機(jī)制，將為慢性瘙癢的治療帶來(lái)新的啟示。

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