李 匯，毛用敏，趙莉莉，崔讓莊，王佩顯

（1.天津醫(yī)科大學 300070；2.天津市胸科醫(yī)院 300051）

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分的主要酶系［1］，金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）是MMPs的內源性特異性抑制劑［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，MMPs／TIMPs的比例失衡與動脈粥樣硬化、冠狀動脈介入術后再狹窄以及心臟重塑等病理過程密切相關［3］。以腺病毒（adenovirus，AdV）為載體介導TIMP1到靶細胞，調節(jié)ECM的生成和降解，從而調節(jié)粥樣斑塊的穩(wěn)定性可能成為冠心病基因治療的新方法［4］。本研究構建攜帶人基質金屬蛋白酶組織抑制劑因子1（human tissue inhibitor of matrix melall oprolease－1，hTIMP1）基因片段的重組腺病毒 Ad－h(huán)TIMP1［5］，并成功感染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞CRL－1730，從而為進一步的在體實驗提供平臺，為基因治療動脈粥樣硬化，穩(wěn)定粥樣斑塊提供靶基因的線索。

1 材料與方法

1.1 材料 AdEasy復制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)（穿梭質粒pAd－Track－CMV和骨架質粒pAdEasy－1）以及包裝細胞系人胚腎細胞（human embryonic kidney 293T，HEK293T）購自北京大學實驗室；pUCm－T載體質粒，BJ 5183菌株、JM109菌株和DH5α菌株均為本實驗室保存。TaqDNA聚合酶為本實驗室提取保存，限制性內切酶BglⅡ、NotⅠ和DNA marker購自TakaRa生物工程（大連）有限公司，PacI購自NEB公司；T4 DNA連接酶、高純度質粒柱式提取試劑盒和脂質體購自Invitrogen公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和 DMEM高糖培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；PCR引物由上海生工公司合成。DNA測序由北京三博遠志生物工程公司完成。

1.2 腺病毒重組質粒的構建

1.2.1 pUC－h(huán)TIMP1重組質粒的構建 Genebank中搜索人TIMP1序列，設計上游引物為：5′－AGA ACC CAC CAT GGC CCC CT－3′；下游引物為：5′－GAT TCA GGC TAT CTG GGA CCG－3′。從人心肌細胞中提取總RNA，反轉錄PCR（reverse transcription－PCR，RT－PCR）得到人 TIMP1的基因片段，連接到pUCm－T載體質粒中，轉化入感受態(tài)JM109細胞，NcoI酶切鑒定正確后行二次轉化入JM109進行擴增，測序正確后提質粒pUC－h(huán)TIMP1。

1.2.2 穿梭質粒 pAdTrack－CMV－h(huán)TIMP1的構建 分別用BglⅡ和NotⅠ雙酶切pUC－h(huán)TIMP1和穿梭質粒pAdTrack－CMV并凝膠回收hTIMP1片段和開環(huán)質粒pAdTrack－CMV，連接后轉化JM109感受態(tài)細胞，酶切鑒定正確后二次轉化JM109擴增，PmeⅠ酶切使之線性化，命名為重組質粒pAdTrack－CMV－h(huán)TIMP1。

1.2.3 同 源 重 組 構 建 重 組 腺 病 毒 質 粒 pAdEasy－GFP－h(huán)TIMP1 電穿孔法（2 500V，5ms）將PemⅠ酶切線性化的pAdTrack－CMV－h(huán)TIMP1重組質粒和 pAdTrack－CMV（空載體陰性對照）分別轉化到含有pAdEasy－1的電感受態(tài)BJ5183中，篩選后BamHI和PacⅠ酶切鑒定。選取重組正確的質粒（pAd－h(huán)TIMP1和pAd－Track）在DH5α菌中大量擴增，高純度質粒柱式提取試劑盒提取質粒，PacⅠ酶切線性化后凝膠回收較大片段。

1.3 重組腺病毒在293T細胞中包裝和擴增

1.3.1 陽離子脂質體法將重組腺病毒轉染293T細胞進行包裝 轉染前1d，將2個60mm培養(yǎng)皿中HEK293T細胞調整為0.6×106個細胞／皿，轉染當天應用脂質體lipofectamine 2000及Plus reagent將pAd－h(huán)TIMP1和pAd－Track轉染到兩皿中，24h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達，倒置相差顯微鏡下觀察細胞病變效應（cytopathogenic effect，CPE）。于轉染后第9天收集細胞，反復凍融法得到重組腺病毒Ad－h(huán)TIMP1和Ad－Track上清液。

1.3.2 包裝好的重組腺病毒感染293T細胞進行擴增 取病毒上清液的1／3感染293T細胞，感染后第3天反復凍融法收集重組腺病毒上清液，反復感染4次于293T細胞中擴增病毒到所需滴度。

1.3.3 重組腺病毒的純化和觀察 CsCl密度梯度離心法純化重組腺病毒顆粒，采用OD260法測定腺病毒的滴度。并用透射電鏡觀察腺病毒形態(tài)。

1.4 腺病毒介導TIMP1在內皮細胞中的表達

1.4.1 分組 體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞CRL－1730，將之分到6孔板中（2.4×105細胞／孔）。分為空白對照組、Track對照組和TIMP1實驗組，每組4個復孔。Ad－Track感染Track對照組，Ad－h(huán)TIMP1感染TIMP1實驗組。48h后觀察并收集細胞。

1.4.2 RT－PCR法擴增細胞TIMP1基因片段，以GAPDH為內參照 采用UNIQ－10柱總RNA抽提試劑盒提取各組人臍靜脈內皮細胞CRL－1730中的總RNA，反轉錄得到cDNA，PCR擴增TIMP1基因片段。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。以電泳條帶的灰度代表mRNA含量，目的基因與內參電泳條帶灰度比值反應目的基因的相對值。采用Gelpro3.1凝膠成像系統(tǒng)對結果進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示。組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 pAdEasy－GFP－h(huán)TIMP1重組質粒 PacⅠ酶切鑒定 RTPCR法從人心肌細胞中擴增hTIMP1，可以得到637bp的特異帶。在pAd－Track－CMV上有2個PacⅠ的酶切位點，將重組子切為一個大片段和一個約4.5kb的小片段（圖1）。

圖1 PacⅠ 酶切pAd－h(huán)TIMP1和pAd－Track重組質粒

圖2 轉染Ad－h(huán)TIMP1重組腺病毒

2.2 293T細胞中包裝并擴增腺病毒 重組腺病毒轉染293T細胞后，第4～5天熒光顯微鏡下可觀察到GFP呈“彗星狀”改變，感染293T細胞后第3天可以觀察到典型的CPE（圖2），純化后OD260法測得重組腺病毒 Ad－h(huán)TIMP1的滴度為1.9×1012v.p／mL，對照重組腺病毒pAd－Track的滴度為0.6×1012v.p／mL。透射電鏡下見病毒顆粒直徑約90nm，呈多面體形狀，絕大多數(shù)病毒顆粒完整（圖3）。腺病毒裂解液TIMP1 PCR，2%瓊脂糖凝膠電泳圖（圖4）。TIMP1實驗組內皮細胞TIMP1mRNA的表達（1.062±0.083）明顯高于空白對照組（0.449±0.128）和Track對照組（0.365±0.164），P＜0.05，見圖5。重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞人臍靜脈內皮細胞CRL－1730（圖6）。

圖3 Ad－h(huán)TIMP1病毒顆粒透射電鏡圖

圖4 腺病毒裂解液TIMP1PCR擴增片段（可見637bp的特異條帶）

圖5 3組TIMP1 2%瓊脂糖凝膠水平電泳圖

圖6 重組腺病毒感染體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞人臍靜脈內皮細胞CRL－1730熒光表達情況（倒置熒光顯微鏡）

3 討 論

MMPs是一類以Zn2＋為輔助因子的蛋白水解酶家族，在體內主要降解ECM。既往研究表明，AS斑塊損傷部位MMPs表達升高，包括屬于間質膠原酶的 MMP1、屬于明膠酶的MMP2和MMP9，以及屬于基質降解酶的 MMP3，而TIMP1和 TIMP2等表達減少［6－7］。Galis等［8］在冠狀 AS中檢測到MMPs與TIMPs的比例失調，認為調節(jié)兩者之間的比例可起到治療AS的作用。

Rouis等［9］報道腺病毒介導TIMP1過表達可以減輕ApoE－／－小鼠的頸動脈粥樣硬化損傷程度，并推測此作用是由于TIMP1抑制MMPs活性保護了細胞外基質，進而抑制了平滑肌細胞的移行所致。該研究中，小鼠喂食6周高膽固醇飲食后注射攜帶TIMP1的重組腺病毒，4周后加以評估。發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊的損傷面積明顯減小。這與之前研究小鼠轉基因過表達人TIMP1抑制 MMPs表達的結果相一致［10－11］。另外，轉染攜帶TIMP1的重組腺病毒（Ad.TIMP1）使豬主動脈內皮細胞過表達TIMP1，可以減少細胞移行及對細胞外基質的侵襲［12］。隨著分子生物學技術的進步，利用分子生物學技術使局部TIMP1過表達，為人們治療AS帶來希望［13］。

本研究采用He等［5］于1998年建立的技術方案，成功地進行了攜帶人TIMP1的重組腺病毒的構建，并采用Zeng等［14］報道的兩步轉化法，即將pAdEsay－1質粒先轉化入BJ5183大腸埃希菌，并制備其電轉化感受態(tài)細胞，再利用電轉化儀將pAd－Track－CMV轉入該菌，進而與細胞內的pAdEsay－1進行同源重組。這種方法與一步轉化法相比，可以大大提高同源重組的效率，縮短實驗時間［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，重組Ad－h(huán)TIMP1可以成功感染內皮細胞使實驗組細胞內TIMP1過表達。為TIMP1作為靶基因用于穩(wěn)定動脈粥樣斑塊的基因治療奠定了基礎。

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