李 冰，郭恩凱，郝好杰，申 晶，程 愈，韓為東，母義明

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1內(nèi)分泌科；2分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

糖尿病是對人類健康威脅最為嚴(yán)重的疾病之一，現(xiàn)行的口服藥物和胰島素治療容易造成血糖波動，不能從根本上治療糖尿病[1]。因此人們開始尋求β細(xì)胞替代治療的新來源。已有實(shí)驗(yàn)將胰腺發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如Pdx-1等直接導(dǎo)入肝細(xì)胞中使之轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素分泌細(xì)胞(insulin producing cell，IPC)，但效率較低，產(chǎn)生的IPC功能不完善[2-4]。OCT4是維持胚胎干細(xì)胞多潛能性和自我更新能力的干性基因之一，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)單獨(dú)OCT4可使成體細(xì)胞去分化以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的重編程，如成纖維細(xì)胞向造血前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[5-7]。Nestin是多譜系前體細(xì)胞的標(biāo)志物之一[8]。不同來源的巢蛋白(nestin)陽性細(xì)胞可體外誘導(dǎo)為神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞以及胰腺內(nèi)外分泌細(xì)胞[9-10]等。本實(shí)驗(yàn)擬探索肝細(xì)胞先經(jīng)去分化再向IPC誘導(dǎo)的重編程路徑，通過觀察nestin在肝細(xì)胞經(jīng)OCT4介導(dǎo)的去分化過程中的表達(dá)，為選擇合適的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)提供參考和依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 6~8周雄性C57BL/6小鼠從本院動物中心引進(jìn)，飼養(yǎng)在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級動物房內(nèi)。包裝慢病毒所用的pwpt-GFP、psPAX2、p MDay2G質(zhì)粒由第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物教研室胡以平教授提供，pwpt-OCT4質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供。肝細(xì)胞培養(yǎng)液購自ScienCell公司。高糖DMEM、Opti-MEM、RPMI Medium 1640、Knockout血清、非必需氨基酸(nonessential aminoacid，NEAA)、谷氨酰胺(L-glutamine)、β巰基乙醇(b-mercaptoethanol)、RNA提取試劑Trizol、Complete F12 Medium購自Invitrogen公司。膠原酶Ⅳ購自Sigma公司。堿性成纖維生長因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)購自Peprotech公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Famantas公司。2×Taq master Mix購自天根生物公司。RT-PCR引物由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成(見表1)。肝細(xì)胞灌流液1、灌流液2和黏附培養(yǎng)基配置參考文獻(xiàn)[11]。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。小鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)方法見參考文獻(xiàn)[11]。

表1 各上下游引物序列Tab. 1 Sequences of different upstream primers

2 慢病毒包裝及濃縮 培養(yǎng)293T細(xì)胞至融合度70%~80%，用定量的質(zhì)粒(pwpt-GFP，psPAX2，p MD2G及pwpt-OCT4)及轉(zhuǎn)染試劑PEI包裝出表達(dá)OCT4或EGFP的慢病毒，濃縮后分別稀釋至1.5×108pfu/ml。

3 OCT4-慢病毒感染原代肝細(xì)胞 使用肝細(xì)胞培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)分離8 h后的肝細(xì)胞，感染0CT4-慢病毒(MOI=15)，并加入polybrene(4 μg/ml)，每次感染12 h，連續(xù)感染兩次，中間間隔24 h。平行對照組感染EGFP-慢病毒，感染方式同OCT4-慢病毒組。感染結(jié)束后換為去分化培養(yǎng)液(Complete F12 Medium+10% knockout血清+1%NEAA+1 mmol/L L-glutamine + 0.1 mmol/L b-mercaptoethanol+10 ng/ml bFGF+10 ng/ml HGF)。

4 RT-PCR監(jiān)測肝細(xì)胞感染OCT4-慢病毒后ALB、AFP、FOXA2及nestin的表達(dá) 將原代肝細(xì)胞(0 d)及感染OCT4-慢病毒后3、5、7、9、12、14、16和18 d的肝細(xì)胞使用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度儀檢測RNA的含量。使用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取1 μl cDNA作為PCR模板，加入2×Taq PCR master Mix 12.5 μl(1×Taq PCR Master Mix)，上、下游引物各1 μl(終濃度0.4 μmol/L)，補(bǔ)足RNAase-free Water至總體積25 μl。以GAPDH作內(nèi)參。每個(gè)基因每一時(shí)間點(diǎn)跑3次PCR，將得到的產(chǎn)物跑1%瓊脂糖凝膠分析，產(chǎn)物使用柯達(dá)1D電泳分析軟件分析，將檢測基因(ALB，AFP，F(xiàn)OXA2及nestin)與對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的GAPDH條帶灰度作比，根據(jù)每個(gè)基因?qū)?yīng)時(shí)間點(diǎn)的3次灰度比值求出均數(shù)，將均數(shù)和時(shí)間作圖(見圖6，7)。

結(jié) 果

1 小鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)采用兩步膠原酶灌流法，用黏附培養(yǎng)基培養(yǎng)6~8 h后肝細(xì)胞已貼壁，更換為肝細(xì)胞培養(yǎng)液。鏡下觀察：肝細(xì)胞活率在90%以上，細(xì)胞呈多邊形或不規(guī)則形，肝細(xì)胞胞體大，多為雙核，折光差，包漿內(nèi)顆粒豐富。見圖1。

2 OCT4-慢病毒感染肝細(xì)胞 為提高慢病毒的感染率，我們采用兩次重復(fù)感染法。因EGFP-慢病毒與OCT4-慢病毒包裝濃縮及稀釋過程相同，故平行對照組EGFP陽性比例能間接反映OCT4的感染效率。對照組感染3 d后EGPF陽性率約為15%，說明OCT4-慢病毒的感染效率約為15%(圖2)。用PCR技術(shù)檢測到OCT4-慢病毒感染3 d的肝細(xì)胞，以O(shè)CT4質(zhì)粒作陽參，未感染的原代肝細(xì)胞作陰參，可見感染3 d后外源OCT4已表達(dá)，表明病毒攜帶的OCT4基因已整合到肝細(xì)胞基因組內(nèi)并開始轉(zhuǎn)錄。見圖3。

圖 1 分離8 h后的小鼠原代肝細(xì)胞(×200)(左)圖 2 對照組感染3 d后EGFP的表達(dá)情況(×200)(中)圖 3 PCR檢測OCT4-慢病毒感染3 d后外源性O(shè)CT4的表達(dá)(右)Fig. 1 Mouse primary hepatocytes 8 hours after isolation(×200)(left)Fig. 2 EGFP expression in control group 3 days after infection(×200)(middle)Fig. 3 PCR showing exogenous OCT4 expression 3 days after OCT4-lentivirus infection(right)

3 病毒感染后肝細(xì)胞形態(tài)變化 我們觀察了3 d、7 d、12 d、16 d的肝細(xì)胞形態(tài)，可見3 d時(shí)肝細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞為單核或雙核，病毒感染的細(xì)胞釋放出包漿內(nèi)顆粒，折光性略有增強(qiáng)(如圖4)；7 d時(shí)肝細(xì)胞變?yōu)闄E圓或類圓形，包漿內(nèi)顆粒明顯減少，細(xì)胞折光性增強(qiáng)，并出現(xiàn)了肝細(xì)胞的增殖(圖4中箭頭所指)，增殖的肝細(xì)胞為類圓形，體積較小，包漿顆粒較少，折光性較強(qiáng)(圖4)；12 d時(shí)肝細(xì)胞增殖更為明顯(圖4)；16 d時(shí)細(xì)胞以增殖的肝細(xì)胞為主，原有的肝細(xì)胞明顯減少(圖4)，提示病毒感染和去分化過程可能刺激了肝細(xì)胞的增殖和分裂。對照組原代肝細(xì)胞在體外活性較難維持，故可見隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，原代肝細(xì)胞數(shù)目減少，活性降低。到培養(yǎng)末期以成纖維及其他間質(zhì)細(xì)胞為主。

圖 4 實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞感染OCT4-慢病毒后及對照組原代肝細(xì)胞的形態(tài)變化，箭頭所示為新生肝細(xì)胞(×400)Fig. 4 Morphology of hepatocytes infected with OCT4-lentivirus in experimental group and primary hepatocytes in control group(arrowhead indicates the newly generated hepatocytes,×400)

4 肝細(xì)胞去分化過程中nestin的表達(dá) 在感染后的0~3 d中，成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物ALB表達(dá)下降，不成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志物AFP以及肝臟發(fā)育早期標(biāo)志物FOXA2表達(dá)上升，表明肝細(xì)胞在OCT4作用下經(jīng)歷由成熟到不成熟的去分化過程，同時(shí)nestin表達(dá)從無到有、由弱變強(qiáng)；在第3~9天內(nèi)，各基因表達(dá)較為恒定。從第12天起，各基因表達(dá)逐漸減弱，至18 d時(shí)已幾近消失(圖5、6)?？梢?，nestin 的表達(dá)從第3天持續(xù)至第12天，結(jié)合圖3中的形態(tài)變化可見，在此期間肝細(xì)胞先丟失原有表型發(fā)生去分化，再出現(xiàn)肝細(xì)胞增殖。其中，從第3天到肝細(xì)胞出現(xiàn)增殖之前的第6天，高表達(dá)nestin并已去分化丟失原有表型的肝細(xì)胞可能具備了向神經(jīng)、胰腺、肌肉等誘導(dǎo)的潛能。

圖 5 PCR監(jiān)測ALB、 AFP、 FOXA2、 nestin以及GAPDH在OCT4-慢病毒感染后3~18 d的表達(dá)Fig. 5 PCR showing expressions of ALB, AFP, FOXA2, nestin and GAPDH on days 3 -18 after OCT4-lentivirus infection

圖 6 ALB、 AFP、 FOXA2 mRNA水平的變化趨勢Fig. 6 ALB, AFP and FOXA2 mRNA expression levels

圖 7 Nestin mRNA 水平的變化趨勢Fig. 7 Nestin mRNA expression level

討 論

隨著糖尿病發(fā)病率逐年上升，β細(xì)胞的替代治療正受到越來越多的關(guān)注。肝細(xì)胞已被證實(shí)可以轉(zhuǎn)分化為IPC；去分化是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過程。我們認(rèn)為，肝細(xì)胞先經(jīng)去分化丟失自身表型，再向IPC誘導(dǎo)，有可能提高重編程的效率和最終得到功能完善的IPC。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，在OCT4-慢病毒感染的最初3 d內(nèi)肝細(xì)胞已發(fā)生了去分化，而重編程另一個(gè)重要問題是誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的選擇。Wiese等[8]對胚胎干細(xì)胞(ESC)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在擬胚體(EBs)形成早期有大量nestin陽性細(xì)胞出現(xiàn)；在將ESC向神經(jīng)、胰腺、肝臟及肌肉細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)均出現(xiàn)了nestin與各譜系前體細(xì)胞標(biāo)志物短暫的共表達(dá)階段，隨著細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟nestin逐漸消失。Milanesi等[12]證實(shí)，骨髓來源的nestin陽性細(xì)胞可體外誘導(dǎo)為成簇的胰島素分泌細(xì)胞及胰腺導(dǎo)管細(xì)胞。從胰腺分離得到的nestin陽性細(xì)胞可誘導(dǎo)為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞，外分泌細(xì)胞及肝細(xì)胞[13]。據(jù)此可以認(rèn)為，nestin是多譜系前體細(xì)胞的標(biāo)志物，nestin的出現(xiàn)提示了細(xì)胞具有向神經(jīng)、胰腺等譜系分化的潛能。因此我們通過監(jiān)測nestin的表達(dá)來決定向IPC的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代肝細(xì)胞不表達(dá)nestin，而在去分化及增殖的過程中nestin表達(dá)增強(qiáng)，可見增殖出現(xiàn)前(3~6 d)高表達(dá)nestin的肝細(xì)胞可能已具備了向IPC誘導(dǎo)的潛能，此誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為高效產(chǎn)生功能完善的IPC提供了重要的參考和依據(jù)。此外，Vaittinen等[14]和Shibuya等[15]證實(shí)，nestin在肌肉或神經(jīng)損傷后的再生過程中表達(dá)增強(qiáng)。而且越來越多的證據(jù)表明，中間絲蛋白參與了一些主要生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)如細(xì)胞分化、增殖以及細(xì)胞的自我保護(hù)等[16-19]。我們首次在OCT4-慢病毒介導(dǎo)肝細(xì)胞去分化過程中證實(shí)了nestin的上述表達(dá)規(guī)律。

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