梁 辰，鄧子輝，張金英，郝秀華，薛 輝，顏光濤

解放軍總醫(yī)院 基礎所生化室，北京 100853

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以進行性認知功能障礙為主要臨床癥狀。臨床病理研究發(fā)現(xiàn)AD患者的癡呆癥狀嚴重程度與腦組織中神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)數(shù)量呈正相關，而NFTs的主要成分是過度磷酸化tau蛋白[1]。因此針對tau蛋白可能成為預防和治療AD的理想途徑。瘦素(leptin)是一種主要由脂肪組織分泌的分子量為16 kU的多肽。它由ob基因編碼，含有167個氨基酸，而血液中的leptin是去掉N端21個氨基酸殘基的信號肽后形成的146個氨基酸的多肽[2]。具有抑制食欲、增加能量消耗、促進脂肪分解、減輕體重等生物學功能。近年的研究發(fā)現(xiàn)，瘦素受體(ObR)在腦內(nèi)廣泛表達，分布在下丘腦、海馬、小腦和大腦皮質等，瘦素作用于這些腦區(qū)可改變神經(jīng)元或突觸的結構、功能及其可塑性，影響神經(jīng)元存活或增殖，并改善學習、記憶及其他認知功能[3-4]。本研究通過檢測AD細胞模型中磷酸化tau蛋白水平的變化情況，探討leptin與阿爾茨海默病的整體關系，以及l(fā)eptin對磷酸化tau蛋白的調(diào)節(jié)作用。

材料和方法

1 材料 人神經(jīng)纖維母細胞瘤細胞系SH-SY5Y(本實驗室保存)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibico)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(北京益利精細化學品公司)；Western Blot超敏發(fā)光液、RIPA裂解液、Trizol RNA提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術公司)；一抗：p-tau(ser396)(sc-101815)、tau(TAU-5)(sc-58860)、Actin(sc-1616-R)、Ob-R(sc-8391)(Santa Cruz Biotechnology)；二抗：山羊抗小鼠IgG/辣根酶標記、山羊抗兔IgG/辣根酶標記(北京中杉金橋公司)。Human Ob-Rb：94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，40循環(huán)，72 ℃ 10 min。Forward：5'-GCCAACAACT GTGGTCTCTC-3'；Reverse：5'-AGAGAAGCACTTG GTGACTG-3'。內(nèi)參GAPDH 246 bp，95 ℃ 50 s，54 ℃50 s，72 ℃ 1 min，30循環(huán)，72 ℃ 7 min。Forward：5'-CCCCTTCATTGACCTCAACTAC-3'；Reverse：5'-G AGTCCTTCCAGGATACCAAAG-3'(北京賽百盛公司)。

2 MTT法檢測ATRA濃度梯度對細胞活性的影響將SH-SY5Y消化、收獲、計數(shù)，各組取5×104/ml細胞100 μl接種到96孔板，每組兩列10個平行孔。加入ATRA濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L，培養(yǎng)6 d后，每孔加入四甲基偶氮唑藍(MTT，濃度為5 mg/ml)100μl，置于37 ℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜100 μl，震蕩5 min，用酶標儀在570 nm處讀取吸光度值(A值)，取平均值為細胞增殖水平。

3 ATRA誘導AD模型的建立 培養(yǎng)SH-SY5Y細胞豐度達到60%，倒掉原有培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入含有ATRA(40 μmol/L)不含血清的DMEM培養(yǎng)基中，連續(xù)誘導6 d建立模型，加入leptin(0.5 μg/ml)作用12 h。

4 細胞形態(tài)學觀察 將處于對數(shù)生長期的細胞以1×106個/孔種于6孔板中，ATRA誘導，分為對照組、模型組，分別于4 h、1 d、2 d、6 d時間點置于倒置顯微鏡下觀察，并拍照。

5 RT-PCR檢測Ob-Rb mRNA的表達 用Trizol RNA提取試劑抽提細胞中總RNA，以Ob-Rb引物在反轉錄酶作用下進行逆轉錄反應，隨后進行33個循環(huán)的PCR擴增。同時，PCR擴增管家基因GAPDH作為參照。

6 Western Blot檢測p-tau表達水平 用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。蛋白上樣量為30 μg，在質量分數(shù)為10%的PAGE上進行SDS-PAGE垂直電泳，電轉移到硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上(100 V，1.5 h)。將NC膜放入封口塑料袋中，加入含5%脫脂奶粉(TBS/T溶解，下同)，4 ℃封閉過夜后，將NC膜轉入另一封口塑料袋中，分別在不同的膜中加入稀釋好的一抗p-tau、Tau-5(各1∶1 000)。37 ℃孵育1 h，TBS/T漂洗NC膜3次，每次10 min。再向膜中加入辣根過氧化物酶標記的IgG抗體(1∶2 000)，37 ℃孵育40 min，TBS/T漂洗NC膜3次，每次10 min。加入發(fā)光液，暗室曝光，使用凝膠掃描儀測其灰度值。使用軟件計算p-tau灰度值比(p-tau 5/Tau-5)，組間進行統(tǒng)計學分析。

7 統(tǒng)計學方法 采用Stata7.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以-x±s表示，組間比較用t檢驗， P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 ATRA對細胞增殖活性的影響 MTT法檢測SH-SY5Y細胞增殖水平顯示，ATRA誘導組在40 μmol/L濃度下A值明顯低于對照組(P＜0.01)，5、10、20 μmol/L ATRA誘導組A值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖1。

圖 1 MTT實驗后各組A值(aP＜0.01, vs control)Fig. 1 A value for each group after MTT assay(aP＜0.01, vs control)

2 ATRA對SH-SY5Y細胞形態(tài)的影響 正常SHSY5Y細胞接種4 h時尚未分化，呈略圓形特征，并少見短形突起(圖2A)；貼壁生長后1 d展現(xiàn)出更類似于神經(jīng)元的表型，大小不一，呈不規(guī)則形，圓形特征丟失，少見梭形(圖2B)；連續(xù)加入ATRA處理2 d，開始展現(xiàn)神經(jīng)元的形態(tài)，即軸突開始生長(圖2C)；ATRA連續(xù)處理6 d，細胞呈現(xiàn)出成熟神經(jīng)元的形態(tài)，軸突伸展并時而與相鄰細胞連接(圖2D)。

圖 2 倒置顯微鏡下ATRA誘導前后細胞形態(tài)(200×)Fig. 2 Cell morphology before and after ATRA induction was observed by inverted microscope(200×)

3 ATRA誘導后ObRb mRNA表達變化 誘導組ObRb mRNA表達顯著升高，提示AD模型建立后leptin發(fā)揮作用，見圖3。

4 Leptin處理后p-tau蛋白表達變化 Western Blot結果顯示，與空白對照組相比，ATRA誘導模型后p-tau蛋白表達水平明顯增加(P＜0.01)，說明模型建立成功，加入leptin(0.5 μg/ml)作用12 h后，與模型相比有明顯降低(P＜0.01)，見圖4。

圖 3 RT-PCR檢測ObRb mRNA表達(P＜0.01)Fig. 3 RT-PCR showing expression of ObRb mRNA(P＜0.01)

圖 4 Western Blot檢測p-tau蛋白的表達(aP＜0.01, vs control)Fig. 4 Western blot showing expression of p-tau protein(aP＜0.01,vs model)

討 論

神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)是AD的兩種最為主要的病理特征之一，主要存在于患者的海馬、杏仁核、前額葉等部位[5]。NFTs主要由過度磷酸化的tau蛋白聚集而形成，tau蛋白在亞細胞水平上主要定位于細胞質，大多在中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域神經(jīng)元的軸突表達[6]。它通過與多種蛋白相互作用來行使其功能，例如tau蛋白可以結合并穩(wěn)定微管系統(tǒng)，可提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元突觸的生長速率和范圍。

Tau有著不同的聚集狀態(tài)，其中可溶性的寡聚體比大分子、不溶性的高度成纖維聚集體更具致病性[7]。Tau蛋白可以被多種蛋白激酶磷酸化，例如：AMP活化的蛋白激酶、應激活化的蛋白激酶、糖原合成酶激酶3、細胞周期依賴性蛋白激酶5、促分裂原活化的蛋白激酶、酪蛋白激酶、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ、微管親和調(diào)控蛋白激酶、蛋白激酶A等[8]。迄今為止，圍繞關注于tau蛋白的異常磷酸化以及tau與AD之間的關系的研究逐漸深入，干擾tau蛋白的過度磷酸化被認為是神經(jīng)退行性疾病治療的關鍵[9]。

瘦素主要由白色脂肪組織分泌，通過下丘腦來調(diào)節(jié)新陳代謝、攝食、能量平衡等生理活動。Vannucci等[10]研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠與正常小鼠比較其大腦體積明顯縮小，并伴有神經(jīng)元密度減低和功能下降，提示leptin可能參與神經(jīng)系統(tǒng)生理活動。

本研究中，檢測到細胞瘦素受體(ObRb)mRNA表達升高，提示leptin可能在此損傷中發(fā)揮直接的作用；在給予外源性leptin作用后，檢測到p-tau蛋白水平也顯著降低，提示leptin可能通過降低p-tau蛋白的表達對AD起到改善作用。從而認為leptin可能作為阿爾茨海默病治療的新靶點，其作用機制值得深入研究。

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4 Moult PR， Harvey J. Hormonal regulation of hippocampal dendritic morphology and synaptic plasticity［J］. Cell Adh Migr， 2008， 2（4）：269-275.

5 王維治．神經(jīng)病學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：1397-1405．

6 Cleveland DW， Hwo SY， Kirschner MW. Physical and chemical properties of purified tau factor and the role of tau in microtubule assembly［J］. J Mol Biol， 1977， 116（2）： 227-247.

7 Morris M， Maeda S， Vossel K， et al. The many faces of tau［J］.Neuron， 2011， 70（3）： 410-426.

8 王建枝，田青．Tau蛋白過度磷酸化機制及其在阿爾茨海默病神經(jīng)元變性中的作用［J］.生物化學與生物物理進展，2012，39（8）：771-777．

9 靳慧，張英東，楊霞，等．tau蛋白相關阿爾茨海默病治療進展［J］.中國老年學雜志，2012，32（6）：1308-1310．

10 Vannucci SJ， Gibbs EM， Simpson IA. Glucose utilization and glucose transporter proteins GLUT-1 and GLUT-3 in brains of diabetic （db/db） mice［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab， 1997， 272（2 Pt 1）：E267-E274.